El objetivo general de este procedimiento es demostrar la integración de tres sistemas de imágenes en un solo dispositivo, lo que permite una medición simultánea de la función mecánica, la dinámica iónica y el cambio geométrico del tejido cardíaco que se contrae. Específicamente, medimos la producción de fuerza del tejido, los transitorios de calcio, los desplazamientos locales y el cambio de forma. La combinación de estas modalidades de imágenes puede ayudar a responder preguntas clave en la enfermedad cardíaca, con importantes implicaciones para el desarrollo de estrategias de tratamiento efectivas.
La principal ventaja de esta técnica es que nos permite estudiar la heterogeneidad de la actividad muscular. El dispositivo utilizado en este protocolo contiene tres sistemas de imágenes capaces de obtener imágenes de la misma muestra, un microscopio de campo brillante, un microscopio de fluorescencia y un tomógrafo de coherencia óptica. Se utilizan una serie de espejos dicroicos para separar la emisión de fluorescencia y la imagen de transmisión de campo brillante.
Las características fundamentales de este dispositivo son dos ganchos de montaje accionados de forma independiente, una cámara de medición con tres ejes ópticamente claros y una línea de disparo externa que sincroniza las cámaras de campo brillante y OCT con un estimulador. En este video, demostramos cómo aislar, preparar e obtener imágenes de las trabéculas cardíacas y presentamos algunos resultados representativos. Después de extirpar un corazón de una rata anestesiada, transfiéralo a la cámara de disección.
Usando dos forrceps curvas, tire de la aorta sobre la cánula de perfusión. Mantenga la aorta en su lugar con un forcep. Mientras tanto, abra la línea de tubería para permitir que la solución de disección fluya a través de la cánula de perfusión.
Una vez que la vasculatura coronaria se elimina de sangre y el corazón está completamente perfundido con solución de disección, asegure la aorta en su lugar con una sutura. Coloque el corazón girando la cánula para que la arteria coronaria izquierda sea visible en la superficie superior. Fije el ápice del corazón en la parte inferior de la cámara de disección.
Corta ambas aurículas. Corte a lo largo del lado derecho del tabique hasta el ápice del corazón. Fije el ventrículo izquierdo abierto a la base de la cámara de disección.
Luego, cortando a lo largo del lado izquierdo del tabique, abra el ventrículo derecho y clavelo también en la base de la cámara de disección. Identifique una trabécula libre en el ventrículo derecho. Usando las tijeras de resorte y un forcep, corte el tejido de la pared que rodea la trabécula.
Luego, corte el tejido de la pared por la mitad, ortogonal a la dirección de la trabécula. Recorte el tejido de la pared hasta que su dimensión sea adecuada para la configuración de montaje utilizada. Deje la trabécula extirpada en la cámara de disección.
Enjuague el agua caliente, el agua destilada y luego la solución de superfusado a través de la cámara de medición. Encienda la fuente de luz del microscopio de campo brillante y presione F1 para habilitar la captura. Ajuste manualmente el gancho aguas abajo hasta que esté centrado en la imagen de campo brillante.
Haga clic en cero eje descendente y, a continuación, deshabilite la opción descendente para habilitar el motor. Mueva el control deslizante del punto de ajuste descendente hasta que el final del enlace se alinee con el borde de la región predeterminada de interés. Vuelva a poner a cero el eje descendente y, a continuación, mueva el control deslizante del punto de consigna descendente a 1.000.
Repita el proceso con el gancho ascendente, pero no mueva el control deslizante del punto de consigna ascendente después de volver a poner a cero el eje ascendente. Haga clic en Mover al montaje. Inicie el sistema de iluminación de fluorescencia alternando el interruptor de la lámpara antes de encender rápidamente los subsistemas del controlador alternando el interruptor principal.
Cambie el modo operativo a turbo blanking presionando el botón de modo en el panel frontal, seguido de dos, luego uno. Presione el botón en línea para habilitar el control externo. Pausar el flujo de superfusado a través de la cámara de medición.
Llene la cámara de montaje con solución de disección. Usando una jeringa de un mililitro, transporte la trabécula desde la cámara de disección hasta la cámara de montaje. Permita que la trabécula descienda a la cámara de montaje a través de la gravedad.
Baje el nivel de fluido en la cámara de montaje para que esté nivelado con la sección media de los ganchos. Ajuste la distancia entre los ganchos para reflejar la longitud de holgura de la trabécula moviendo el control deslizante del punto de consigna aguas abajo. Usando un microscopio para ayudar a la visualización, agarre ligeramente una de las piezas de tejido final con forrceps y móntela en el gancho aguas arriba.
Monte la otra pieza de tejido final en el gancho aguas abajo. Una vez montada de forma segura, mueva la trabécula de nuevo a la cámara de medición presionando move to chamber y reanude el flujo de superfusado. Establezca la frecuencia del estímulo en uno, la duración del estímulo en 10 y el voltaje del estímulo en 10.
Comience la estimulación presionando el estímulo. Encienda el sistema de iluminación de campo brillante. Presione F1 y seleccione una región de interés que encierra un área estriada de la interfaz de usuario.
Haga clic en Calcular la longitud del sarcómero para calcular la longitud media del sarcómero en la región resaltada. Aumente la longitud muscular hasta que la longitud promedio del sarcómero sea de aproximadamente 2,32 micras. Mueva el músculo ajustando el control deslizante del punto de ajuste central en la pestaña de control central y de separación para que el borde del gancho aguas abajo sea visible dentro de la imagen de campo brillante.
Recopile la información de fluorescencia para 10 contracciones. Aumente el valor del punto de consigna central en 200 y recopile otras 10 contracciones de información de fluorescencia. Repita este proceso hasta que la imagen de campo brillante contenga el gancho aguas arriba.
Recopile el valor de la ventana final de información de fluorescencia. Devuelva la trabécula a una posición central estableciendo el valor del punto de consigna central en cero. Reduzca la frecuencia de estímulo a 0,2 Hertz y cambie del superfusado K-H a la solución de carga Fura-2.
Mida la señal de fluorescencia cada 10 minutos. Visualice la señal en la pestaña de señal PMT. Después de que la señal de 360 nanómetros haya aumentado en un factor de 10, devuelva la frecuencia del estímulo a un Hertz y vuelva a la solución de superfusato K-H.
Verifique la medición de la relación cada 10 minutos hasta que la señal se estabilice, momento en el cual puede comenzar la recopilación de datos. Devuelva el músculo a la posición donde el borde del gancho aguas abajo está presente dentro de la imagen de campo brillante. Capture la información de fluorescencia haciendo clic en Habilitar fuente de fluorescencia.
Comience a transmitir datos de hardware. En la interfaz de usuario de imágenes de campo brillante, establezca el modo de captura en disparador externo, aumente la velocidad de fotogramas a 100 Hertz y establezca el número de imágenes a capturar en 100. Pulse control-shift-S, seguido de F1, para registrar los datos de imágenes de campo brillante para esta ventana.
Aumente el valor del punto de consigna central en 200 y repita el proceso de captura de campo brillante. Continúe con el protocolo de escaneo hasta que se hayan recopilado los datos de imagen para la ventana final. Devuelva la trabécula a una posición central estableciendo el valor del punto de consigna central en cero.
Encienda la fuente de iluminación OCT girando la tecla maestra, presionando el botón de encendido, seguido del botón SLDs. Cubra el cabezal del galvanómetro y haga clic en obtener fondo para medir el patrón de interferencia de fondo y restarlo de la medición. Establezca el modo de captura de imágenes en vista en vivo.
Centra la trabécula en los ejes X e Y ajustando los valores de desplazamiento X e Y. Con la trabécula centrada, escanee a lo largo del eje Y ajustando la posición Y para encontrar las posiciones correspondientes a los ganchos aguas arriba y aguas abajo. Tenga en cuenta estas posiciones hacia abajo.
Establezca el rango Y en la diferencia absoluta entre estos valores divididos por 10. Establezca el modo de captura de imagen en estímulo activado, rango X a 100 y haga clic en el botón Establecer parámetros activos. Haga clic en transmitir datos y, a continuación, en Adquirir.
Para capturar la información regional de calcio y campo brillante para toda la longitud de la trabécula presentada aquí, se requirieron siete posiciones musculares. Esta cifra de la fuerza promedio de cada una de las posiciones superpuestas sugiere que la fuerza de contracción no fue perturbada por este movimiento, revelando que no había dependencia de la posición del acto de producción de fuerza. Estos escaneos recolectados mediante tomografía de coherencia óptica a una velocidad de 100 Hertz se segmentaron utilizando el complemento ImageJ, Weka.
Cada sección transversal aparece distorsionada debido a la diferencia entre las resoluciones lateral y de profundidad. Esto se corrigió escalando cada eje de forma independiente con su respectiva resolución. Después de escalar la C-scan cruda de la trabécula, el músculo es aproximadamente cilíndrico.
El reflejo de la pared de la cámara de medición a veces puede superponerse con los datos musculares, pero el software de segmentación se puede entrenar para dar cuenta de esto. Una vez segmentado, el área de la sección transversal a lo largo de la longitud del músculo se puede calcular a lo largo de la contracción. Tenga en cuenta que esta trabécula en particular tiene una rama pequeña.
El movimiento de la rama es evidente aproximadamente a mitad de camino a lo largo de la trabécula. Finalmente, las imágenes segmentadas se pueden convertir en mallas para ayudar a la construcción de modelos geométricos. Los datos de imagen capturados en cada una de las siete posiciones a una velocidad de 100 fotogramas por segundo se unieron para crear una sola imagen completa de la trabécula.
La proporción de la fluorescencia omitida asociada con la luz de excitación de 340 y 380 nanómetros se correlaciona con el calcio intracelular después de que la trabécula se haya cargado con Fura-2. El promedio de 10 transitorios de calcio intracelulares de cada ventana están alineados con la región en la que se les extrayó. Mientras que el pico de los transitorios para esta trabécula parece razonablemente consistente, el calcio diastólico se redujo a lo largo de su longitud.
Del mismo modo, los resultados del seguimiento del desplazamiento y los cálculos de la longitud del sarcómero también indican la presencia de variabilidad regional. La técnica de seguimiento sin marcadores utilizada es capaz de calcular el desplazamiento de cada píxel. La idoneidad de las estimaciones de longitud del sarcómero se probó en función de la anchura y amplitud del ajuste gaussiano a la señal FFT.
Estas condiciones no se cumplieron en la región muscular entre cero y 500 micras, por lo que no se pudo calcular allí ninguna información sobre la longitud del sarcómero. Dados los desplazamientos asociados, es probable que los sarcómeros de esta región se alargaran durante la fase contráctil de la contracción. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar las trabéculas cardíacas y prepararlas para imágenes multimodales de manera confiable.
Este proceso establece una vía para recopilar un conjunto de datos necesarios para la construcción de modelos de elementos finitos fisiológicamente informados de la contracción del tejido cardíaco.
