光コヒーレンストモグラフィーを用いた三次元腫瘍回転楕円体の縦断的形態学的および生理学的監視

三次元腫瘍スフェロイドは、生体内の腫瘍の組織特異的特性を模倣することができ、単純な2D細胞培養よりも抗癌創薬に対してより臨床的に関連するデータを提供する。当社のイメージング技術である光学コヘレンス断層撮影は、数百ミクロンの大きさの単一の腫瘍神経の3D構造を容易に視覚化し、しばしば数秒以内にその形態および仕事の出没のより正確な特徴付けを提供することができる。3D球体モデルを使用すると、創薬のタイムラインを短縮し、コストを削減し、患者により効果的に新薬を提供することができます。

腫瘍クラスターの球形を形成することは、実験の重要なステップの1つです。丸底の右の超低い取り付けプレート、およびセルシード後の適切な遠心分離速度を選択することが重要です。原稿に記載されているように培養フラスコで興味深い細胞を増殖させることによって、この実験を開始する。

標準的な条件下でインキュベーター内の細胞を維持し、毎日その健康状態を監視します。必要に応じてメディアを更新します。マルチウェルプレートで3D細胞培養を行う場合は、まず、培養フラスコから培地を取り出し、細胞を殺菌して33度前温めたPBSで洗浄する。

その後、トリプシンEDTAを1ミリリットル加えて細胞を再中断し、摂氏37度で3分間インキュベートします。トリプシンを希釈するために培養培地を3ミリリットル加えます。この細胞懸濁液を15ミリリットルの遠心分離管に移し、遠心分離機を500G、室温で5分間移動します。

その後、上清を取り除き、あらかじめ温めた培養培地の4ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。細胞濃度を決定するには、サンプルを1滴下してヘモサイトメーターにヒパチし、細胞を数えます。所望の播種濃度に希釈する。

200マイクロリットルの細胞懸濁液を超低添付着体の各ウェルに、丸底マルチウェルプレートの各ウェルに、1ミリリットル当たり3,000細胞の濃度で、1ウェルあたり約600細胞を達成する。播種直後、室温で、7分間、利用可能な最低速度でプレート全体を遠心分離します。プレートを37°C、5%Co2でインキュベーターに入れ、3日ごとに培地をリフレッシュします。

まず、本稿の回路図に従って、OCTシステムのリファレンスアームとサンプルアームを構築する。次に、キロメートル、グレーディング、F-Thetaレンズ、ラインスキャンカメラを含む分光計を構築します。プレートアダプターを使用して、マルチウェルプレートを固定位置に保持します。

撮像前に、2D傾斜ステージを使用してマルチウェルプレートの傾きと回転を修正し、異なるウェルからの焦点面の変動を最小限に抑えるために遷移ステージに取り付けた回転ステージを修正します。次に、プレートのエッジがステージの動きの方向と平行になるように回転を調整し、井戸がOCT画像内で同じ水平位置にとどまるようにします。次に、プレートが光学表に平行になるように傾斜ステージを調整し、ウェルが撮像用に同じ垂直位置にとどまるようにします。

腫瘍回転楕円体画像化の日に、インキュベーターからマルチウェルプレートを取り除く。OCTイメージングシステムの下に転送し、プレートアダプタに置きます。プレートの高さを調整するには、変換ステージの Z 方向に沿ってプレートを移動します。

カスタムイメージングソフトウェアでは、腫瘍回転楕円体全体をカバーするために目的のOCTスキャン範囲を設定し、その発達段階に応じて、設定を保存するためにパラメータを保存をクリックします。次に、腫瘍回転楕円体の最適化された XZ および YZ OCT プレビューを表示します。回転楕円体を含むプレートのすべてのウェルについて、腫瘍回転楕円体の3D OCT画像を1つずつ取得します。

プレビューイメージを表示するには、プレビューボタンをクリックします。OCT画像を取得するには、取得ボタンをクリックします。OCT データ取得の全体的な段階移動プロセスを記録します。

すべての腫瘍回転楕円体に最適な画質を確保するために、プレートアダプターを正確に調整する必要があり、中央値の体積は同じである必要があります。カスタム C+ 処理コードを使用して、腫瘍スフェロイドの 3D OCT データセットを処理して、OCT 構造画像を生成します。2D OCT 画像を 3 つの断面、XY、XZ、YZ 平面で回転楕円体の重心を横切って使用し、スフェロイド画像のコラージュを生成します。

目的のソフトウェアを使用して回転楕円体の 3D レンダリングを取得するには、最初に SD OCT データをソフトウェアにロードします。[セルを超える] パネルをクリックし、新しいボリュームを追加して、3D レンダリングに使用するブレンド モードを選択します。表示角度を調整するには、マウスポインタを使用して画像をドラッグし、原稿の説明に従って定量化を進めます。

HCT116細胞ラインスフェロイドの無化OCT画像のコラージュは、処理されたデータから生成され、他の2Dハイスループットイメージングシステムの画像と同等の結果が得られました。さらに、96のウェルから2次元断面スフェロイド画像のコラージュを生成し、スフェロイド高さを監視し、スフェロイドの不均一性を垂直方向に可視化した。3D レンダリングされた回転楕円体画像のコラージュは、事前に定義された角度から生成して、全体の 3D 形状を視覚化し、回転楕円体の丸さを評価できます。

一般的なOCT後処理後、腫瘍スフェロイドの3D OCT構造像が得られた。OCTデータから、3D表面ポストとXZ、YZ、XY直交スライスを生成し、腫瘍回転楕円体の構造を任意の方向に可視化した。単一の腫瘍スフェロイドの縦方向モニタリングを行い、その直径、高さ、ボクセルベースの体積を特徴付け、21日間の開発中に大きさと体積の成長曲線を生成した。

ここでは、11日目に回転楕円体が破壊され、21日目に完全に崩壊しました。縦方向追跡は、腫瘍スフェロイドにおける死細胞領域の増加を示した。腫瘍回転楕円体の3Dレンダリング画像は、赤で強調された壊死領域の増加によって示されるように、7日目から14日目までの死細胞領域の出現と成長を示した。

壊死領域の割合が増加するにつれて、腫瘍回転楕円体は完全な形状を維持することができなかったため、崩壊した。このイメージングプラットフォームを使用すると、3Dイメージングモデル、広大なクリーチャーモデル、共培養モデルなど、他の複雑な腫瘍球モデルをさらに探索して、生体内腫瘍をよりよくシミュレートすることができます。当社のハイスループットOCTイメージングシステムは、がん創薬における薬物スクリーニングの代替アプローチを提供します。

これはまた、様々な生物医学の適用のための3Dバイオファブリケートサンプルを特徴づけるものです。