Las células SBNET bien diferenciadas son de crecimiento lento y difíciles de propagar. Las pocas líneas celulares establecidas no están fácilmente disponibles para los investigadores. Para superar estas limitaciones, desarrollamos este protocolo de cultura 3D.
La ventaja de esta técnica sobre el método tradicional de establecer una línea celular SBNET es que se pueden obtener cultivos 3D y se pueden realizar pruebas de drogas en tres semanas. Este método se puede aplicar a otros tumores neuroendocrinos como tumores neuroendocrinos del páncreas. Después de obtener una muestra SBNET de paciente resegurado, córtela en cubos de cinco milímetros y guárdela en 25 mililitros de DMEM F12 medio en un tubo cónico para el transporte.
Incubar los tumores en medio de lavado preparado según las instrucciones del manuscrito durante 15 minutos. Luego transfiéralos a un nuevo plato y picarlos a menos de un milímetro usando tijeras curvas estériles. Transfiera los tejidos picados a un nuevo tubo de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de medio de lavado, luego centrifugar la muestra a 500 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.
Desechar el sobrenadante y resuspender los pellets en 10 mililitros de medio de lavado con colagenasa y DNase. Permita que los tumores picados digieren a 37 grados Celsius con temblor lento durante 90 minutos. Es importante no digerir en exceso las muestras del tumor.
Demasiada enzima o tiempo de incubación más largo matará a las células SBNET. Una vez finalizada la digestión, centrifuga el tubo a 500 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet en 15 mililitros de medio de lavado.
Coloque un colador celular de 70 micrómetros encima de un nuevo tubo de 50 mililitros y transfiera 10 mililitros del tampón de lavado a través del colador. Gire el tampón de lavado dentro del tubo para evitar que las células se peguen a los lados. A continuación, filtre la suspensión celular a través del colador.
Centrifugar las células a 500 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 microlitros de medio de lavado. Coloque el tubo sobre hielo y utilice cinco microlitros de las células para el recuento celular con un hemocitoómetro.
Calcular el número de células, luego repetir la centrifugación para eliminar el sobrenadante y resuspender las células en ECM líquido a una concentración de un millón de células por mililitro. A continuación, transfiera de cinco a 20 microlitros de esferoides SBNET en ECM a una placa de 96 pozos y coloque la placa en una incubadora de 37 grados Celsius para permitir que el ECM líquido se solidifique. Añadir 200 microlitros de medio de cultivo SBNET a cada bien que contenga esferoides o cultivo de los organoides en los medios de células madre como se describió anteriormente.
Utilice una pipeta P1000 para transferir los organoides a un tubo de 1,5 mililitros y centrifugar el tubo a 1.500 veces g durante un minuto para extraer el sobrenadante. Lave el cultivo con un mililitro de PBS y centrífuga de nuevo para eliminar el sobrenadante. A continuación, fije los organoides añadiendo 500 microlitros de paraformaldehído e incubando durante 15 minutos.
Después de la incubación, lave el cultivo dos veces con un mililitro de PBS. Añadir 500 microlitros de PBS con 3%BSA y 0.1%Triton X-100 para permeabilizar el cultivo. Incubar el tubo durante cinco minutos, luego lavar los organoides tres veces con un mililitro de PBS y 3%BSA.
A continuación, incubar el cultivo con anticuerpos primarios durante una hora y luego repetir los lavados con PBS y BSA. Incubar con los anticuerpos secundarios y repetir los lavados asegurándose de aspirar y desechar todo sobrenadante. Para tomar una imagen de los esferoides, agregue cinco microlitros de medio de montaje que contengan DAPI y utilice una pipeta P20 para transferir cinco microlitros de los esferoides a un portaobjetos de vidrio.
Selle la diapositiva con un cubreobjetos y una imagen con un microscopio de fluorescencia utilizando los objetivos 10, 20 y 40X. Romper mecánicamente el ECM con una pipeta P1000 y transferirlo a un tubo estéril de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo a 1.000 g a cuatro grados centígrados.
A continuación, retire todo el sobrenadante y coloque el tubo sobre hielo. Añadir de dos a cuatro veces el volumen del nuevo ECM al pellet y mezclar el contenido del tubo pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces asegurándose de evitar la introducción de burbujas de aire. Transfiera de cinco a 20 microlitros de la mezcla ECM y SBNET a una nueva placa de 96 pozos y permita que el ECM se solidifique.
A continuación, cubra el ECM solidificado con el nuevo medio SBNET y coloque la placa en la incubadora. Si envía esferoides SBNET a otro laboratorio, transfiera los esferoides con el nuevo ECM a un matraz T25 y permita que el ECM se solidifique. Llene el matraz con el medio esferoide SBNET, atornille bien la tapa y prepare el paquete de envío.
Al recibir el cultivo de esferoides, retire el medio de cultivo y repita los pasos anteriores para volver a poner los esferoides en el cultivo. La tasa de crecimiento del esferoide SBNET fue monitoreada con imágenes microscópicas. Los esferoides SBNET tardan aproximadamente 14 días en duplicarse en tamaño cuando los medios de referencia cultural se cambian una vez a la semana.
Después de 14 días en la cultura, los esferoides SBNET no aumentan de tamaño. Los esferoides se tiñeron con anticuerpos específicos contra la sinaptofisina, la cromogranina A y el SSTR2 y se fueron imageinados con microscopía de inmunofluorescencia. Los datos mostraron que estos marcadores están localizados en el citoplasma y en la membrana de las células SBNET.
Para garantizar la especificidad de los anticuerpos, se realizaron los mismos procedimientos de tinción en una línea organoides a partir de un tumor de páncreas que no expresa sinaptofisina, cromogranina A y SSTR2 y no se detectó ninguna señal verde. La principal ventaja de las imágenes de inmunofluorescencia es que se puede realizar en cuatro horas y dar información de tinción similar a la inmunohistoquímica. Culturing SBNET as spheroids es una técnica valiosa para identificar fármacos que pueden inhibir el crecimiento de SBNET.
Los esferoides fueron tratados con rapamicina e inhibidor de mTOR. Después de cinco días, el esferoide tratado con rapamicina formó una estructura similar a la uva y se volvió apoptótico o necrótico. Al intentar este procedimiento, es importante pre-mojar el colador celular y el tubo de recolección con medio de lavado.
Esto evitará que las células SBNET se peguen al colador celular y al tubo de plástico. Con este protocolo, los científicos y clínicos pueden establecer cultivos esferoides SBNET a partir de tumores resecados, compartirlos con otros laboratorios y usarlos para probar medicamentos aprobados por la FDA.
