Gli sferoidi tumorali tridimensionali possono imitare le proprietà specifiche dei tumori in vivo, fornendo dati più rilevanti dal punto di vista clinico per la scoperta di farmaci anti-cancro rispetto alla semplice coltura cellulare 2D. La nostra tecnica di imaging, la tomografia a coerenza ottica, può facilmente visualizzare la struttura 3D di un singolo nervo tumorale, con una dimensione di diverse centinaia di micron, e fornire una caratterizzazione più accurata della sua morfologia e infestazione lavorativa, spesso in pochi secondi. Utilizzando il modello sferico 3D possiamo potenzialmente abbreviare la tempistica di scoperta dei farmaci, ridurre i costi e portare nuovi farmaci ai pazienti in modo più efficace.
Formare la forma sferica dell'ammasso tumorale è un passo fondamentale nel nostro esperimento. È importante scegliere la piastra di attacco ultra-bassa giusta con il fondo rotondo e la corretta velocità di centrifugazione dopo la semina cellulare. Inizia questo esperimento coltivando cellule interessanti in un pallone di coltura come descritto nel manoscritto.
Mantenere le cellule in un'incubatrice in condizioni standard e monitorare il loro stato di salute ogni giorno. Aggiornare i contenuti multimediali in base alle esigenze. Per eseguire la coltura cellulare 3D in piastre multi-pozzo, rimuovere prima il mezzo dal pallone di coltura cellulare e lavare le cellule con PBS sterilizzato a 33 gradi Celsius prerifabbrito.
Quindi aggiungere un millilitro di Tripside-EDTA per rimorsi le cellule e incubare per tre minuti a 37 gradi Celsius. Aggiungere tre millilitri di mezzo di coltura per diluire la tripina. Trasferire questa sospensione cellulare in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e centrifugare a 500 G e temperatura ambiente per cinque minuti.
Quindi rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare con quattro millilitri di mezzo di coltura pre-riscaldato. Per determinare la concentrazione cellulare, hypat una goccia di campione su un emocitometro e contare le cellule. Diluire la concentrazione di semina desiderata.
Seme 200 microlitri di sospensione cellulare in ogni pozzo di un attacco ultra-basso, piastra multi-pozzo a fondo rotondo, ad una concentrazione di 3.000 cellule per millilitro, per raggiungere circa 600 cellule per pozzo. Subito dopo la semina, centrifugare l'intera piastra alla velocità più bassa disponibile, a temperatura ambiente, per sette minuti. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius e 5%Co2, assicurandosi di aggiornare il mezzo ogni tre giorni.
In primo luogo, costruire il braccio di riferimento e il braccio campione del sistema oct, seguendo gli schemi di questo manoscritto. Quindi, costruisci lo spettrometro, incluso un chilometro, una scarpata, un obiettivo F-Theta e una telecamera di scansione di linea. Utilizzare un adattatore piastra per mantenere la piastra multi-pozzo in posizione fissa.
Prima dell'imaging, correggere l'inclinazione e la rotazione della piastra multi-pozzo utilizzando uno stadio di inclinazione 2D e uno stadio di rotazione montato sullo stadio di transizione per ridurre al minimo la variazione del piano focale da diversi pozzi. Quindi regolare la rotazione per assicurarsi che i bordi della piastra siano paralleli alla direzione del movimento del palco, in modo che i pozzi rimangano nelle stesse posizioni orizzontali nelle immagini dello Strumento di personalizzazione di Office. Quindi regolare lo stadio di inclinazione per assicurarsi che la piastra sia parallela al tavolo ottico, in modo che i pozzi rimangano nelle stesse posizioni verticali per l'imaging.
Il giorno dell'imaging degli sferoidi tumorali, rimuovere la piastra multi-pozzo dall'incubatrice. Trasferirlo sotto il sistema di imaging oct e posizionarlo sull'adattatore della piastra. Per regolare l'altezza della piastra, spostarla lungo la direzione Z della fase di traslazione.
Nel software di imaging personalizzato, impostare un intervallo di scansione OCT desiderato per coprire l'intero sferoide tumorale, a seconda delle sue fasi di sviluppo, e fare clic su Salva parametri per salvare l'impostazione. Quindi mostra le anteprime ottimizzate XZ e YZ OCT degli sferoidi tumorali. Acquisire immagini 3D OCT di sferoidi tumorali uno per uno per tutti i pozzi della piastra contenente sferoidi.
Per visualizzare l'immagine di anteprima, fare clic sul pulsante di anteprima. E per acquisire l'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office, fare clic sul pulsante acquisisci. Registrare il processo di spostamento della fase complessiva dell'acquisizione dei dati dello Strumento di personalizzazione di Office.
Per garantire la qualità ottimale dell'immagine per tutti gli sferoidi tumorali, l'adattatore a piastre deve essere sintonizzato con precisione e il volume mediano deve essere lo stesso. Utilizzare un codice di elaborazione C+ personalizzato per elaborare set di dati 3D OCT di sferoidi tumorali per generare immagini strutturali dello Strumento di personalizzazione di Office. Usa immagini oct 2D in tre piani di sezione trasversale, XY, XZ e YZ attraverso il baricentro dello sferoide per generare il collage di immagini sferoidi.
Per ottenere il rendering 3D dello sferoide utilizzando un software desiderato, caricare prima i dati dello Strumento di personalizzazione di Office SD nel software. Fate clic sul pannello di superamento, quindi aggiungete nuovo volume e scegliete la modalità di fusione da utilizzare per il rendering 3D. Per regolare l'angolo di visualizzazione, usate il puntatore del mouse per trascinare l'immagine e procedere con la quantificazione come descritto nel manoscritto.
Dai dati elaborati è stato generato un collage di immagini oct non stampate di sferoidi a linea cellulare HCT116, con risultati paragonabili alle immagini di altri sistemi di imaging ad alta produttività 2D. Inoltre, è stato generato il collage di immagini sferoidi trasversali 2D da 96 pozzi per monitorare le altezze degli sferoidi e visualizzare l'inomogeneità degli sferoidi nella direzione verticale. Un collage di immagini sferoide renderizzate in 3D può essere generato da qualsiasi angolazione definita per visualizzare la forma 3D complessiva e valutare la rotondità dello sferoide.
Dopo la post-elaborazione generale degli OCT, sono state ottenute immagini strutturali 3D OCT di uno sferoide tumorale. Dai dati degli OCT, sono stati generati un palo di superficie 3D e fette ortogonali XZ, YZ e XY per visualizzare la struttura dello sferoide tumorale in qualsiasi direzione. Il monitoraggio longitudinale di un singolo sferoide tumorale è stato eseguito per caratterizzarne il diametro, l'altezza e il volume a base di voxel, generando le curve di crescita in dimensioni e volume durante lo sviluppo di 21 giorni.
Qui, lo sferoide è stato interrotto il giorno 11 e completamente crollato il giorno 21. Il tracciamento longitudinale ha mostrato l'aumento delle aree cellulari morte nello sferoide tumorale. Le immagini rese in 3D dello sferoide tumorale hanno mostrato l'aspetto e la crescita delle regioni delle cellule morte dal settimo al giorno 14, come dimostrato dall'aumento delle aree necrotiche evidenziate in rosso.
Con l'aumentare della percentuale delle aree necrotiche, lo sferoide tumorale non riusciva a mantenere la sua forma perfetta, e quindi collassò. Con questa piattaforma di imaging possiamo esplorare ulteriormente altri complessi modelli di sfera tumorale, come il modello di imaging 3D, il modello di creatura vasta e i modelli di co-coltura per simulare meglio i tumori in vivo. Il nostro sistema di imaging OCT ad alta produttività può fornire un approccio alterativo per lo screening dei farmaci nella scoperta di farmaci contro il cancro.
Questo è qualcosa di anche caratterizzato, campioni biofabbricati 3D per varie applicazioni biomediche.
