Трехмерные сфероиды опухоли могут имитировать специфические для тканей свойства опухолей in vivo, предоставляя более клинически значимые данные для обнаружения противоопухолевого препарата, чем простая культура 2D-клеток. Наша методика визуализации, оптическая когерентная томография, может легко визуализировать 3D-структуру одного опухолевых нервов, размером с несколько сотен микрон, и обеспечить более точную характеристику его морфологии и работы infest, часто в течение нескольких секунд. Используя 3D сферическую модель, мы потенциально можем сократить сроки обнаружения препарата, снизить стоимость и более эффективно доставить пациентам новые лекарства.
Формирование сферической формы опухолевого кластера является одним из важнейших этапов нашего эксперимента. Важно выбрать правую ультра-низкую пластину крепления с круглым дном и правильную скорость центрифугации после посева клеток. Начните этот эксперимент с выращивания клеток интересного в культуре колбы, как описано в рукописи.
Поддерживайте клетки в инкубаторе в стандартных условиях и следите за их состоянием здоровья каждый день. Обновите средства массовой информации по мере необходимости. Для выполнения 3D-клеточной культуры в многофункциональных пластин, сначала удалить среду из колбы культуры клеток, и мыть клетки с стерилизованной, 33 градусов по Цельсию предварительно нагревается PBS.
Затем добавьте один миллилитр трипсина-ЭДТА, чтобы повторно использовать клетки и инкубировать в течение трех минут при 37 градусах цельсия. Добавьте три миллилитров среды культуры, чтобы разбавить трипсин. Перенесите эту подвеску клетки в 15-миллилитровую центрифугу и центрифугу при температуре 500 г и комнатной температуре в течение пяти минут.
Затем удалите супернатант и повторно наполните клеточные гранулы четырьмя миллилитров предварительно разогретой среды культуры. Чтобы определить концентрацию клеток, гипат одну каплю образца на гемоцитометр, и подсчитать клетки. Разбавить до желаемой концентрации посева.
Семя 200 микролитров клеточной подвески в каждой колодец ультра-низкой крепления, круглое дно многоясовой пластины, в концентрации 3000 клеток на миллилитр, для достижения около 600 клеток на колодец. Сразу после посева центрифуга всей пластины на самой низкой доступной скорости, при комнатной температуре, в течение семи минут. Поместите тарелку в инкубатор при 37 градусах по Цельсию и 5%Co2, убедившись, что обновляется среды каждые три дня.
Во-первых, построить эталонную руку и образец руки системы OCT, следуя схемам в этой рукописи. Затем постройте спектрометр, включающий километр, сортировку, объектив F-Theta и камеру сканирования линии. Используйте адаптер пластины, чтобы держать пластину с несколько хорошо в фиксированном положении.
Перед визуализацией исправляйте наклон и вращение пластины с помощью 2D-стадии наклона и этапа вращения, установленного на переходной стадии, чтобы свести к минимуму изменение фокусной плоскости из разных скважин. Затем отрегулируйте вращение, чтобы обеспечить параллельные края пластины направлении движения сцены, чтобы скважины оставались в тех же горизонтальных положениях на изображениях OCT. Затем отрегулируйте этап наклона, чтобы убедиться, что пластина параллельна оптическому столу, так что скважины остаются в тех же вертикальных местах для изображения.
В день визуализации сфероидов опухоли удалите многоясную пластину из инкубатора. Перенесите его под систему визуализации OCT и поместите на адаптер пластины. Чтобы настроить высоту пластины, переместите ее по направлению к этапу перевода.
В пользовательском программном обеспечении для визуализации установите желаемый диапазон сканирования OCT, чтобы охватить весь сфероид опухоли, в зависимости от стадии его развития, и нажмите сохранить параметры, чтобы сохранить настройки. Затем покажите оптимизированные предварительные просмотры сфероидов опухолей на X и Y' OCT. Приобрети 3D OCT изображения опухолевых сфероидов один за другим для всех скважин пластины, содержащей сфероиды.
Чтобы просмотреть изображение предварительного просмотра, нажмите кнопку предварительного просмотра. А чтобы получить изображение OCT, нажмите кнопку приобретения. Запись общего этапа процесса перемещения данных OCT.
Для обеспечения оптимального качества изображения для всех сфероидов опухоли, адаптер пластины должны быть настроены точно и средний объем должен быть одинаковым. Используйте пользовательский код обработки C для обработки 3D наборов данных OCT опухолевых сфероидов для генерации структурных изображений OCT. Используйте 2D-изображения OCT в трех поперечных, XY, X и Y' плоскостях через центроид сфероида для создания коллажа сфероидных изображений.
Чтобы получить 3D визуализацию сфероида с помощью желаемого программного обеспечения, сначала загрузите данные SD OCT в программное обеспечение. Нажмите на панель surpass, затем добавьте новый объем и выберите режим смешивания для использования для 3D-рендеринга. Чтобы настроить угол обзора, используйте указатель мыши, чтобы перетащить изображение и продолжить количественную оценку, описанную в рукописи.
Коллаж из невозмутимых OCT-изображений сфероидов клеточной линии HCT116 был создан на основе обработанных данных, результаты сравнимы с изображениями из других 2D высокой пропускной способности систем визуализации. Кроме того, коллаж из 2D поперечных фероидных изображений из 96 скважин был создан для мониторинга высот сфероидов и визуализации неоднородности сфероидов в вертикальном направлении. Коллаж из 3D-рендероидных изображений может быть создан с любого заранее определенного угла, чтобы визуализировать общую 3D-форму и оценить округлость сфероида.
После общей OCT после обработки, 3D OCT структурные изображения сфероида опухоли были получены. На основе данных OCT для визуализации структуры сфероида опухоли в любом направлении были созданы 3D поверхностный столб и ортогональные ломтики X, Y и XY. Продольный мониторинг одного сфероида опухоли был проведен для характеристики его диаметра, высоты и объема на основе воксела, генерируя кривые роста в размерах и объеме в течение 21-дневного развития.
Здесь сфероид был нарушен на 11-й день, и полностью рухнул на 21-й день. Продольное слежение показало увеличение областей мертвых клеток в сфероиде опухоли. 3D-изображения сфероида опухоли показали появление и рост областей мертвых клеток с седьмого дня до 14-го дня, о чем свидетельствует увеличение красных выделенных некротических областей.
По мере увеличения доли некротических областей, сфероид опухоли не мог поддерживать свою идеальную форму, и, следовательно, рухнул. С помощью этой платформы визуализации мы можем дополнительно исследовать другие сложные модели опухолевых сфер, такие как 3D-модель изображения, обширная модель существ и модели совместной культуры, чтобы лучше моделировать опухоли in vivo. Наша высокой пропускной способности OCT визуализации система может обеспечить измененный подход для скрининга наркотиков в открытии рака наркотиков.
Это то, что также характеризуется, 3D биофабрикатов образцов для различных биомедицинских приложений.
