Este protocolo describe la síntesis y aplicación de PODS, un nuevo reactivo para la bioconjuriación específica del sitio de proteínas y péptidos. Esta tecnología representa una notable mejora con respecto a las bioconjugas tradicionales basadas en maleimidos-tiol. La mayor ventaja de este procedimiento es la simplicidad con la que se hace el reactivo.
El método permite sintetizar el reactivo en prácticamente cualquier laboratorio. En un matraz de fondo redondo de 10 mililitros, disolver 100 miligramos del tiol aminofenil oxadiazole en tres mililitros de metanol. A la solución, añadir 360 microlitros de diisopropylethylamine y una barra de agitación magnética.
Selle el matraz con un tapón de goma y revuelva la solución durante 10 minutos a temperatura ambiente. Con una jeringa de vidrio de un mililitro, haga un agujero a través del tapón de goma y agregue rápidamente 32 microlitros de yodometano a la mezcla. Deje que la mezcla reaccione durante 45 minutos a temperatura ambiente.
En un matraz de fondo redondo de 25 mililitros, disuelve 387 miligramos del ácido carboxílico protegido por boc en 10 mililitros de diclorometano. A la solución, añadir 480 microlitros de diisopropylethylamine, 264 miligramos de EDCI, 200 miligramos de la anilina, y una barra de agitación magnética. Selle el matraz con un tapón de vidrio y deje que la reacción se revuelva durante cinco días a temperatura ambiente.
Una vez completada la reacción, transfiera la mezcla de reacción a un embudo separador y lave tres veces con cinco mililitros de ácido clorhídrico de un molar. Recoger la fase orgánica y transferirla al embudo separador. A continuación, lave la fase orgánica con un molar de carbonato sódico seguido de agua.
A continuación, recoger la fase orgánica y añadir sulfato de magnesio para eliminar cualquier rastro de agua. A continuación, filtre la mezcla con una frita de vidrio mediana. Con un evaporador rotativo, retire los disolventes volátiles a presión reducida para permitir un sólido blanquecino.
Después de esto, redissolve el sólido aislado en 10 mililitros de acetato de etilo. A continuación, precipite el producto a través de la adición gradual de 30 mililitros de ciclohexano. Filtrar la solución utilizando una frita de vidrio medio para obtener el producto carbamato como polvo blanco.
En un matraz de fondo redondo de 10 mililitros, disuelva 30 miligramos del carbamato en cuatro mililitros de diclorometano. Añadir lentamente 49 miligramos de ácido cloroperbenzoico al 70%m y una barra de agitación magnética a la mezcla, y sellar el matraz con un tapón de vidrio. Revuelva la solución durante la noche a temperatura ambiente, produciendo en última instancia una mezcla amarilla.
Al día siguiente, transfiera la mezcla a un embudo separador. A continuación, lave la mezcla con hidróxido de sodio de 0,1 molar seguido de agua. Recoger la fase orgánica y añadir sulfato de magnesio para eliminar cualquier rastro de agua.
A continuación, filtre la mezcla con una frita de vidrio mediana. En un matraz de fondo redondo de 25 mililitros, disuelve 30 miligramos del carbamato en dos mililitros de diclorometano. Agregue una barra de agitación magnética a la mezcla.
Y 400 microlitros de ácido trifluoroacético y sellar el matraz con un tapón de vidrio. A continuación, revuelva la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante tres horas. Una vez completada la reacción, retire los volátiles sometidos a presión reducida a temperatura ambiente utilizando un evaporador rotatorio para obtener un residuo aceitoso.
Disolver el residuo aceitoso en siete mililitros de agua. Y transfiera a un embudo separador. Lavar la solución acuosa tres veces con cuatro mililitros de acetato de etilo.
En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, disolver 10 miligramos de PODS y 300 microlitros de dimetil sulfóxido. A continuación, agregue 26 microlitros de N, N-diisopropylethylamine a la solución. Disolver 15,2 miligramos de DOTA NCS en 100 microlitros de dimetil sulfóxido, y combinar la solución con la solución PODS.
Selle el tubo de microcentrífuga y permita que la reacción se incuba durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, diluir 61 microlitros de una solución de trastuzumab con 859 microlitros de PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros de baja unión a proteínas. A esta mezcla, añadir 6,7 microlitros de una solución recién hecha de 10 mililitrolares de TCEP en agua.
Añadir 73 microlitros de una solución PODS-DOTA de un miligramo por mililitro a la mezcla de reacción. Por último, selle el tubo de microcentrífuga e incubar la solución durante dos horas a temperatura ambiente. La síntesis DE PODS es robusta y fiable.
La desproteinación y la sustitución del tiol de aminofenilo oxadiazole ofrecía a tioéter uno en rendimiento cuantitativo. La ligadura de tioéter uno y el ácido carboxílico protegido por boc produjo un compuesto dos en un 55% de rendimiento. La oxidación sueló compuesto tres en 90% de rendimiento.
Y la eliminación del grupo protector de los bocs produjo PODS en un rendimiento del 98%. La identidad de cada producto se confirmó a través de RMN de protones, RMN de carbono y MS de alta resolución. Una variante de isotiocianato del quelante DOTA se acopuso a la amina colgante de PODS para obtener el quelante bifuncional en un 75% de rendimiento. La identidad del producto se confirmó a través de RMN de protones, RMN de carbono y MS de alta resolución. Aquí se muestra una bioconjugación selectiva en el sitio de PODS-DOTA al anticuerpo de orientación HER2 trastuzumab.
Los enlaces de disulfuro de la región de bisagra del anticuerpo se redujeron selectivamente, y el anticuerpo se incubaba con PODS-DOTA para permitir que el inmunoconjugado dota tuviera un rendimiento del 80%. El análisis MALDI-TOF reveló un grado de etiquetado de 1,8 DOTA por anticuerpo. Lo cual sigue siendo consistente en una gama de anticuerpos IgG1 humanos, humanizados y quiméricos.
Sin embargo, las mismas condiciones producen inmunoconjugados con un grado de etiquetado de 1,5 para los anticuerpos IgG1 murinos. Debido a la sensibilidad a la luz de este compuesto, es importante mantener todas las reacciones en los vasos recubiertos de papel de aluminio. Esto aumentará el rendimiento general del producto.
Si bien este protocolo describe la síntesis de PODS-DOTA, se puede aplicar un procedimiento similar a una amplia gama de cargas potenciales, incluyendo fluoróforos, toxinas y otros quelantes. Este método facilitará la construcción de inmunoconjugados bien definidos, homogéneos y altamente estables que se pueden utilizar en una amplia variedad de campos. Es importante recordar que el yodometano añadido en el primer paso de este experimento puede tener efectos nocivos, y por lo tanto debe utilizarse en una campana de humo.
