Ce protocole décrit la synthèse et l’application du PODS, un nouveau reagent pour la bioconjugation spécifique au site des protéines et des peptides. Cette technologie représente une nette amélioration par rapport aux bioconjugations traditionnelles à base de maleimide-thiol. Le plus grand avantage de cette procédure est la simplicité avec laquelle le reagent est fait.
La méthode permet de synthétiser le reagent dans pratiquement n’importe quel laboratoire. Dans un flacon à fond rond de 10 millilitres, dissoudre 100 milligrammes du thiol oxadiazole aminophényle en trois millilitres de méthanol. À la solution, ajouter 360 microlitres de diisopropyléthylamine et une barre magnétique.
Sceller le flacon à l’aide d’un bouchon en caoutchouc et remuer la solution pendant 10 minutes à température ambiante. À l’aide d’une seringue en verre d’un millilitre, percer un trou dans le bouchon en caoutchouc et ajouter rapidement 32 microlitres d’iodométhane au mélange. Laisser le mélange réagir pendant 45 minutes à température ambiante.
Dans un flacon rond-fond de 25 millilitres, dissoudre 387 milligrammes de l’acide carboxylique protégé par boc dans 10 millilitres de dichloromethane. À la solution, ajouter 480 microlitres de diisopropyléthylamine, 264 milligrammes d’EDCI, 200 milligrammes d’aniline et une barre magnétique. Sceller le flacon à l’aide d’un bouchon de verre et laisser la réaction remuer pendant cinq jours à température ambiante.
Une fois la réaction terminée, transférer le mélange de réaction dans un entonnoir séparateur et laver trois fois avec cinq millilitres d’acide chlorhydrique d’une molaire. Recueillir la phase organique et la transférer dans l’entonnoir séparateur. Lavez ensuite la phase organique avec du carbonate de sodium uni molaire suivi de l’eau.
Ensuite, recueillir la phase organique et ajouter du sulfate de magnésium pour éliminer toute trace d’eau. Filtrer ensuite le mélange à l’aide d’une frite en verre moyen. À l’aide d’un évaporateur rotatif, retirer les solvants volatils sous une pression réduite pour se permettre un solide blanc éteint.
Par la suite, redissolvez le solide isolé en 10 millilitres d’acétate d’éthyle. Ensuite, précipitez le produit par l’ajout progressif de 30 millilitres de cyclohexane. Filtrer la solution à l’aide d’une frit en verre moyen pour obtenir le produit carbamate comme poudre blanche.
Dans un flacon rond-fond de 10 millilitres, dissoudre 30 milligrammes du carbamate en quatre millilitres de dichloromethane. Ajouter lentement 49 milligrammes d’acide chloroperbenzoïque à 70 % et une barre magnétique au mélange, et sceller le flacon à l’aide d’un bouchon en verre. Remuer la solution toute la nuit à température ambiante, en fin de compte en donnant un mélange jaune.
Le lendemain, transférer le mélange dans un entonnoir séparateur. Lavez ensuite le mélange avec de l’hydroxyde de sodium 0,1 molaire suivi de l’eau. Recueillir la phase organique et ajouter le sulfate de magnésium pour éliminer toute trace d’eau.
Filtrer ensuite le mélange à l’aide d’une frite en verre moyen. Dans un flacon rond-fond de 25 millilitres, dissoudre 30 milligrammes du carbamate en deux millilitres de dichloromethane. Ajouter une barre magnétique au mélange.
Et 400 microlitres d’acide trifluoroacétique et sceller le flacon avec un bouchon de verre. Puis remuer le mélange de réaction à température ambiante pendant trois heures. Une fois la réaction terminée, retirez les substances volatiles sous pression réduite à température ambiante à l’aide d’un évaporateur rotatif pour obtenir un résidu huileux.
Dissoudre les résidus huileux dans sept millilitres d’eau. Et transférer dans un entonnoir séparateur. Lavez la solution aqueuse trois fois avec quatre millilitres d’acétate d’éthyle.
Dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre, dissoudre 10 milligrammes de PODS et 300 microlitres de sulfoxyde de diméthyle. Ajouter ensuite 26 microlitres de N, N-diisopropyléthylamine à la solution. Dissoudre 15,2 milligrammes de DOTA NCS dans 100 microlitres de sulfure de diméthyle, et combiner la solution avec la solution PODS.
Sceller le tube de microcentrifugeuse et laisser la réaction couver toute la nuit à température ambiante. Ensuite, diluer 61 microlitres d’une solution de stock de trastuzumab avec 859 microlitres de PBS dans un tube de microcentrifugeuse à faible teneur en protéines de 1,5 millilitre. À ce mélange, ajouter 6,7 microlitres d’une solution fraîchement faite de 10 milli molaires de TCEP dans l’eau.
Ajouter 73 microlitres d’une solution PODS-DOTA d’un milligramme par millilitre au mélange de réaction. Enfin, sceller le tube de microcentrifugeuse et incuber la solution pendant deux heures à température ambiante. La synthèse PODS est robuste et fiable.
La déprotéination et la substitution du thiol d’oxadiazole d’aminophenyl ont offert thioether un dans le rendement quantitatif. Ligation de thioether un et l’acide carboxylique boc-protégé a produit le composé deux dans le rendement de 55%. L’oxydation a offert le composé trois dans le rendement de 90%.
Et l’élimination du groupe de protection des bocs a donné pods dans le rendement de 98%. L’identité de chaque produit a été confirmée par proton NMR, carbon NMR, et MS à haute résolution. Une variante isothiocyanate-portante du chelator DOTA a été couplée à l’amine pendentif de PODS pour obtenir le chelator bifonctionnel dans le rendement de 75%. L’identité du produit a été confirmée par proton NMR, NMR de carbone, et MS à haute résolution. La bioconjugation sélective du PODS-DOTA au trastuzumab d’anticorps her2-ciblage est montrée ici.
Les liens de disulfide de la région de charnière de l’anticorps ont été sélectivement réduits, et l’anticorps a ensuite été incubé avec PODS-DOTA pour permettre à l’immunoconjugate dota-portant un rendement de 80%. L’analyse MALDI-TOF a révélé un degré d’étiquetage de 1,8 DOTA par anticorps. Ce qui reste cohérent dans une gamme d’anticorps IgG1 humains, humanisés et chimériques.
Cependant, les mêmes conditions produisent des immunoconjugués avec un degré d’étiquetage de 1,5 pour les anticorps murine IgG1. En raison de la sensibilité à la lumière de ce composé, il est important de garder toutes les réactions dans les navires recouverts de papier d’aluminium. Cela augmentera le rendement global du produit.
Bien que ce protocole décrit la synthèse de PODS-DOTA, une procédure similaire peut être appliquée à un large éventail de cargaisons potentielles, y compris les fluorophores, les toxines et d’autres chélateurs. Cette méthode facilitera la construction d’immunoconjugués bien définis, homogènes et hautement stables qui peuvent être utilisés dans une grande variété de domaines. Il est important de se rappeler que l’iodométhane ajouté à la première étape de cette expérience peut avoir des effets nocifs, et doit donc être utilisé dans une hotte de fumée.
