Este método puede ayudar a descifrar los pasos en el intercambio de hilos de ADN y revela las funciones de moléculas de diferentes proteínas implicadas en la combinación durante la reparación. Con esta técnica podemos monitorear el intercambio de hilos de ADN en tiempo real sin ninguna interrupción de la reacción y utilizar el quirófano para determinar la cinética de cada paso de reacción. Con algunos ajustes menores, esta técnica se puede aplicar para estudiar las actividades de proteínas de recombinación purificadas derivadas de otras especies, como mamíferos y plantas.
Demostrando el procedimiento estará Kentaro Ito, un Correos Doc de mi laboratorio. Para comenzar, prepare el búfer de reacción A de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, agregue 36 nanomole 16FA-oligonucleótido al tampón para el ensayo de emparejamiento de ADN.
Incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Añadir la proteína RAD-51 a una concentración final de 1,5 micro moles a la mezcla e incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Añadir la proteína SWI5-SFR1 a una concentración final de 0,15 micro moles a la mezcla, e incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos adicionales.
Transfiera 1,5 mililitros de la mezcla en una cubeta de cuarzo de 1,0 por 1,0 cm que contenga un agitador magnético. Inserte la cubeta en un espectrofluorómetro y proceda a ajustar el controlador de temperatura y el agitador magnético. Registre el cambio en la emisión de fluorescencia FAM a 525 nanómetros tras la excitación a 493 nanómetros a intervalos de un segundo durante 100 segundos.
Finalmente, con una jeringa, inyecte ADN de doble cadena etiquetado por ROX a una concentración final de 36 nano moles en la cubeta. Registre el cambio en la emisión de fluorescencia en intervalos de un segundo durante 30 minutos. Para comparar los espectros de fluorescencia entre los sustratos y los productos finales, inserte cada cubeta que contenga los 16 FA-oligonucleótidos con o sin RAD-51 en un espectrofluorómetro e incubar a 37 grados Celsius durante cinco minutos.
A continuación, registre la emisión de fluorescencia FAM en 500 a 600 nano metros tras la excitación a 493 nanómetros. Para probar el efecto de RAD-51 en los espectros de fluorescencia, añada RAD-51 a una concentración final de 1,5 micropoos. Y incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante cinco minutos.
Por último, registre los espectros de fluorescencia de 500 a 600 nanómetros tras la excitación a 493 nanómetros. La máxima eficiencia FRET se obtiene midiendo la reducción máxima de la intensidad de fluorescencia cuando todo el sustrato de ADN de una sola cadena se convierte en ADN de doble cadena en el ensayo de emparejamiento. O midiendo el aumento máximo en la intensidad cuando todo el sustrato de ADN de doble cadena se convierte en ADN de una sola cadena en el ensayo de desplazamiento.
En ambos ensayos, la adición de proteína RAD-51 no afectó a la emisión de fluorescencia de FAM, ni a su eficiencia de enfriamiento por las rocas. Los efectos de las reacciones espontáneas entre los DNAs del sustrato y el posterior blanqueo fotográfico son pequeños. Como lo demuestran los cambios insignificantes en la emisión de FAM sin RAD-51, en comparación con los cambios sustanciales observados con RAD-51.
La adición del complejo SWI5-SFR1 estimula fuertemente la actividad de emparejamiento de RAD-51. La reacción de emparejamiento se simula utilizando un modelo de tres pasos, que consiste en la formación del primer intermedio de tres hilos, la transición al segundo intermedio, y la liberación del ADN de una sola cadena y la formación del dúplex hetero. Una comparación del modelo de tres pasos con un modelo de dos pasos indica que el modelo de tres pasos es un mejor ajuste para simular el emparejamiento de ADN, sin o con el complejo SWI5-SFR1.
La constante de equilibrio calculada de cada paso de reacción, con o sin SWI5-SFR1, muestra que el complejo SWI5-SFR1 no estimula la formación del primer intermedio de tres hilos, pero estimula fuertemente la transición entre los dos intermedios de tres hilos y la liberación de ADN SS. Es esencial verificar que cada lote de proteína purificada esté libre de contaminación por nucleasas y helicas.
