Los ensayos de captura y extensión del bucle D son los primeros en permitir la cuantificación imparcial y directa de los pasos de formación y extensión del bucle D durante la recombinación homóloga en células de levadura en crecimiento mitótico. Esta técnica independiente de la viabilidad permite el estudio de proteínas en el metabolismo del bucle D que de otro modo no sería posible desenredar de los roles posteriores, simplemente mirando los productos BIR. En el futuro, prevemos la transición de estos ensayos a células humanas para comprender mejor el papel de las proteínas clave, incluidos BRCA2 y los casos de floración y kilo de Warner en la recombinación homóloga.
Comience centrifugando las muestras durante cinco minutos. Resuspenda el pellet en 2,5 mililitros de 1x solución de psoraleno y transfiéralo a una placa de Petri de 60 por 15 milímetros. Para ningún control de reticulación, resuspenda el pellet en 2,5 mililitros de solución TE1.
A continuación, coloque la fuente de luz UV en la parte superior del agitador orbital, configurada a 50 RPM. Para entrecruzar las muestras utilizando un reticulante UV con bombillas de onda larga de 365 nanómetros. Coloque las placas de Petri de uno a dos centímetros por debajo de la fuente de luz UV durante 10 minutos agitando suavemente una placa de plástico o plexiglás previamente enfriada.
Luego transfiera la muestra a un nuevo tubo de 15 mililitros. Enjuague la placa de Petri con 2,5 mililitros de solución TE1 y agréguela al tubo. Centrifugar las muestras durante cinco minutos.
Deseche el sobrenadante y guarde el pellet a menos 20 grados centígrados. Coloque las muestras en hielo para descongelarlas. Simultáneamente, precaliente un baño seco a 30 grados centígrados.
Resuspender las muestras en un mililitro de tampón de esferoplasting y transferirlas a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Luego agregue 3.5 microlitros de solución de zymolyase y mezcle suavemente golpeando. Incubar a 30 grados centígrados durante 15 minutos.
Y luego coloque los tubos sobre hielo. Centrifugar durante tres minutos y colocar las muestras en hielo. Lave las muestras tres veces en un tampón de esferaturado de mililitro y centrifugar las muestras durante tres minutos.
Resuspender las muestras en un mililitro de tampón enzimático de restricción fría. Centrifugar durante tres minutos y colocar las muestras en hielo. Repita el lavado una vez.
Resuspender las muestras en un mililitro de tampón enzimático de restricción 1x frío. Divida la muestra en partes iguales en dos. Centrifugar las muestras durante tres minutos a 16.000 g a cuatro grados centígrados.
Resuspender un tubo de cada muestra en 180 microlitros de tampón enzimático de restricción 1.4x con oligos hibridantes y otro tubo en 180 microlitros de tampón enzimático de restricción 1.4x sin oligos hibridantes. Congele rápidamente las muestras en nitrógeno líquido. Descongele las muestras en hielo.
Precaliente un baño seco a 65 y otro a 37 grados centígrados. Alícuota 36 microlitros de la muestra en un nuevo tubo de microcentrífuga y cuatro microlitros de 1% SDS y mezclar golpeando suavemente el lado del tubo. Incubar a 65 grados centígrados durante 15 minutos con golpecitos suaves cada cinco minutos.
Colocar las muestras en hielo inmediatamente después de la incubación. Añadir 4,5 microlitros de Triton X-100 al 10% y mezclar por pipeteo. Agregue de 20 a 50 unidades de enzima de restricción EcoR1 o HindIII de alta fidelidad a cada muestra.
E incubar a 37 grados centígrados durante una hora con una agitación suave cada 20 a 30 minutos. Durante este tiempo, baño seco precalentado a 55 grados centígrados y un baño de agua a 16 grados centígrados. Agregue 8.6 microlitros de 10% SDS a cada muestra y mezcle pipeteando y roscando.
Incubar a 55 grados centígrados durante 10 minutos. Añadir 80 microlitros de Triton X-100 al 10% a cada muestra y mezclar por pipeteo. Agregue 660 microlitros de 1x tampón de ligadura sin ATP, un ATP milimolar a pH 8.0 y ocho unidades de ADN ligasa T4 a cada muestra, y mezcle suavemente por inversión.
Incubar 16 grados centígrados durante 1,5 horas con una inversión cada 30 minutos. Colocar las muestras en hielo inmediatamente después de la incubación. Después de la purificación del ADN como se describe en el protocolo, use dos microlitros de ADN purificado para configurar una reacción qPCR de 20 microlitros de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para cada muestra, configure cinco reacciones de control y una reacción de cuantificación y ejecútelas por duplicado. El análisis del ensayo DLC dos horas después de la rotura de doble cadena o la inducción DSB mostró que la reticulación del psoraleno es crítica y la eficiencia depende del tiempo entre la recolección de la muestra y la qPCR. Los valores de ARG4 Cp fueron similares entre las muestras reticuladas, pero más bajos para la muestra sin reticulación, ya que el ADN sin enlaces cruzados amplifica de manera más eficiente.
Para todas las muestras, el control de qPCR de ligadura intermolecular estuvo dentro del rango. La inducción DSB robusta se evidenció por una señal de qPCR baja para el control que amplifica a través del sitio de reconocimiento de endonucleasa HO. Se observaron resultados similares para el control de qPCR EcoR1.
La señal DLC con oligo hibridante se calculó normalizando al control de ligadura intermolecular. El análisis del ensayo DLE realizado a las seis horas posteriores a la inducción DSB mostró que los valores de CP de ARG4 fueron similares entre la muestra con y sin oligos hibridantes. El control de qPCR de ligadura intermolecular reveló una señal aceptable para la muestra con y sin oligos hibridantes, pero una señal menor para la muestra fallida.
En las tres muestras, hubo una inducción DSB robusta. Dado que la escisión de HindIII depende de la restauración del sitio de la enzima de restricción por el oligo hibridante. Hubo una diferencia significativa en la amplificación a través del sitio de escisión HindIII en la hebra resecada entre el ancho y sin muestras oligo.
Se observó una diferencia menor en la amplificación a través del sitio en la hebra extendida porque aquí la escisión HindIII también depende de la extensión. Las muestras y el tampón deben mantenerse fríos en todo momento. Las muestras deben congelarse rápidamente después de la resuspensión en tampón enzimático de restricción fría 1.4x con o sin oligos hibridantes.
Los efectos posteriores de la formación y extensión del bucle D en la formación del producto pueden estudiarse mediante Southern blotting o ensayos genéticos de punto final. Los efectos sobre la búsqueda de homología pueden investigarse utilizando PC alto. La inmunoprecipitación de cromatina puede proporcionar información sobre el reclutamiento de una proteína de interés.
