La modificación post traslacional de proteínas por la pequeña proteína ubiquitina participa en muchos eventos en la célula. Este estudio presenta una adición original a la caja de herramientas para el análisis de la ubiquitinación de proteínas. Utilizamos técnicas de enriquecimiento y espectrometría de masas para descubrir el ubiquitinoma profundo.
Hemos realizado varias mejoras en el análisis de péptidos diGly que se originan a partir de proteínas ubiquitinadas. Estos incluyen fraccionamiento de péptido crudo antes del enriquecimiento, y la aplicación de ajustes de fragmentación de péptidos más avanzados en el Orbitrap. En conjunto, esto resulta en una mayor cobertura del ubiquitinom.
Varios aspectos del protocolo son difíciles de describir con palabras. La visualización de algunos de los pasos clave es esencial para poder repetir estos análisis por parte de diferentes operadores en un laboratorio diferente. El procedimiento lo demostrará Karel Bezstarosti, que es técnico sénior en mi laboratorio.
Comience por preparar células cultivadas o tejido cerebral de ratón para el experimento. Si trabaja con células, anule el pellet celular de una placa de cultivo cuadrada de 150 centímetros en dos mililitros de hielo frío, 50 mililitros Tris HCL con 0.5%desoxicolato de sodio. Hierva el lesate a 95 grados centígrados durante cinco minutos.
Luego sonicar a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Si utiliza tejido cerebral de ratón in vivo, lyse en un tampón de hielo frío que contenga 100 mililitros Tris HCL, desoxicolato de sodio milimolar y N-lauroylsarcosinato de sodio milimolar. Sonicar el izado durante 10 minutos a cuatro grados Centígrados.
Luego hierve durante cinco minutos a 95 grados centígrados. A continuación, cuantificar la cantidad total de proteínas utilizando un kit de ensayo de proteína BCA de absorbancia calorimétrica, que debe ser al menos varios miligramos para la inmunoprecipitación de péptido diGly exitoso. Para los experimentos siLAC, mezcle las proteínas etiquetadas ligeras y pesadas en una proporción de uno a uno en función de la cantidad total de proteínas.
Reduzca todas las proteínas con cinco TDT milimétricas durante 30 minutos a 50 grados centígrados. Y posteriormente los alquiló con 10 yodoacamida milimétrica durante 15 minutos en la oscuridad. A continuación, realice la digestión proteica con Lys-C durante cuatro horas.
Y la digestión de la trippsina durante la noche a 30 grados centígrados, o a temperatura ambiente. Al día siguiente, divida la muestra en dos tubos Eppendorf de dos mililitros y añada TFA a la muestra digerida a una concentración final de 0,5% Centrifugarla a 10.000 veces G durante 10 minutos para precipitar y eliminar todo el detergente. Recoger el péptido que contiene sobrenadante para el fraccionamiento posterior.
Utilice cromatografía C18 de fase inversa de pH alto para fraccionar los péptidos trípticos. Prepare un cartucho vacío de seis mililitros lleno de 0,5 gramos de material de fase estacionaria durante unos 10 miligramos de digerido proteico. Cargue los péptidos en la columna preparada y lávelos con aproximadamente 10 volúmenes de 0,1%TFA, seguido de 10 volúmenes de agua.
Eluir los péptidos en tres fracciones utilizando volúmenes de 10 columnas de 10 formados de amonio milimétrico con siete, 13,5 y 50%acetonitrilo, respectivamente. Luego, litholyse todas las fracciones. Un lote de anticuerpos de motivo remanente de ubiquitina conjugados con la proteína A lodo de agarosa se divide en seis fracciones iguales.
Disolver las tres fracciones de péptidos de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y girar hacia abajo los escombros. Agregue los sobrenadantes de las tres fracciones a la suspensión de cuentas mientras mantiene las otras tres fracciones sobre hielo. Y incubarlos durante dos horas a cuatro grados centígrados en una unidad de rotadores.
Luego, gira las cuentas. Transfiera el sobrenadante a un nuevo lote de cuentas. Y repite la incubación con las tres fracciones restantes de lodo de cuentas.
Almacene los sobrenadantes para el posterior análisis global del proteome. Y transfiera las perlas a 200 puntas de pipeta de microlitro equipadas con un tapón de filtro GFF. Coloque las puntas en tubos de 1,5 mililitros equipados con un adaptador de punta centrífuga y lave las cuentas tres veces con 200 microlitros de tampón IAP helado, seguido de tres lavados con agua purificada helada.
Gire hacia abajo las columnas a 200 veces G durante dos minutos entre lavados, asegurándose de no dejar que la columna se seque. Después del lavado final, eluir los péptidos con dos ciclos a 50 microlitros de 0.15%TFA. Desalgar los péptidos con una punta de etapa C18 y secarlos con centrifugación al vacío.
Realice experimentos LC-MS/MS en un espectrómetro de masas sensible acoplado a un sistema LC de nanoflujo. La columna se configura de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y se mantiene a 50 grados centígrados. Utilice el espectrómetro de masas en modo de adquisición dependiente de datos.
Recoja los espectros de masa MS1 a alta resolución con un ajuste de objetivo controlado por ganancia automatizado de 4E5 y un tiempo máximo de inyección de 50 milisegundos. Realice el análisis de espectrometría de masas en el primer modo más intenso, utilizando el método de velocidad máxima con un tiempo de ciclo total de tres segundos. A continuación, realice una segunda ronda de análisis de DDA MS en el primer modo menos intenso, lo que asegurará la detección óptima de péptidos de baja abundancia.
Filtrar los iones precursores según sus estados de carga y asignación de pico monoisotópico. Y excluya los precursores interrogados previamente dinámicamente durante 60 segundos. Aísle los precursores de péptidos con un filtro de masa cuadrúpedo ajustado a una anchura de 1,6 Thomson.
A continuación, recoja los espectros MS2 en la trampa de iones en un control de ganancia automatizado de 7E3 con un tiempo máximo de inyección de 50 milisegundos y la energía de colisión HCD del 30% Analizar los archivos sin procesar de espectrometría de masas utilizando un motor de búsqueda adecuado, como la suite de software MaxQuant disponible libremente basada en el motor de búsqueda De Anddromeda. Abra MaxQuant y seleccione los archivos de datos sin procesar adecuados. Establezca el número de procesadores y haga clic en la pestaña de parámetros específicos del grupo.
Seleccione la digestión y permita tres escotes perdidos. A continuación, seleccione modificaciones y agregue diGly a las modificaciones de variables. Seleccione la pestaña de parámetros globales y agregue la base de datos de secuencia de proteínas correcta.
Deje el resto de la configuración como predeterminada y pulse Start para realizar la búsqueda de la base de datos. Para el análisis cuantitativo de los archivos de experimentos SILAC, establezca la multiplicidad en dos y seleccione las etiquetas de aminoácidos pesados. Cuando finalice la búsqueda, importe los archivos de texto en Perseus.
Este protocolo se utilizó para identificar sitios de ubiquitinación en proteínas de células cultivadas y material in vivo mediante la detección de péptidos diGly con nanoflujo LC-MS/MS. Se realizaron varias mejoras en el protocolo existente, lo que dio lugar a un mayor número de péptidos diGly detectados. Se realizó un fraccionamiento crudo en tres fracciones antes de la inmunoprecipitación.
Una de las fracciones contiene el propio péptido diglítico tripríptico modificado K48 de ubiquitina, que se caracteriza por un amplio pico en el cromatograma LC. Además, el régimen de fragmentación de péptidos se ajustó para combinar las corridas de LC-MS con los regímenes de fragmentación primero y más bajos más altos en el procedimiento de análisis de datos, que produjo más de 4.000 péptidos diGly únicos adicionales. Más de 23.000 péptidos diGly se pueden identificar rutinariamente a partir de una sola muestra de células de HeLa tratadas con un inhibidor del proteasoma.
De todos los péptidos diGly identificados en tres pantallas biológicas, más de 9.000 estaban presentes en los tres, mientras que más de 17.000 estaban presentes en al menos dos de cada tres réplicas. El número de identificaciones de péptidos depende en gran medida de la cantidad de material de entrada. Se puede esperar un número aproximado de péptidos diGly identificados dependiendo del material de partida, pero estos números son sólo estimaciones y también dependerán del tipo de espectrómetro de masa utilizado.
Al llevar a cabo este protocolo, la experiencia previa con métodos proteómicos basados en espectrometría de masas y manejo y análisis de cantidades de muestras minúsculos sería sin duda ventajosa. El software MaxQuant podría ser reemplazado por cualquier otro algoritmo de búsqueda de base de datos. También se puede utilizar un tipo diferente de espectrómetro de masas.
Los resultados en términos de identificaciones de péptidos pueden diferir ligeramente, pero esto es típico para cualquier ensayo proteómico basado en espectrometría de masas. La ubiquitina es importante en el progreso de la degradación de proteínas mediadas, pero también desempeña un papel en muchos otros procesos en la célula. Un conocimiento más profundo de la ubiquitina como modificación post traslacional es crucial para entender mejor su función.
