Este método permite identificar la ubiculación de la proteína CENP-A etiquetada por EYFP. También se puede aplicar a la proteína humana CENP-A con diferentes pruebas y otras proteínas. La principal ventaja de esto es que se puede utilizar para identificar EYFP CENP-A K124R sitios ubicuos con significado biológico crucial.
Podría ampliarse para investigar las modificaciones post-traduccionales de una amplia gama de proteínas funcionales. Comience preparando las proteínas A cuentas unidas con anticuerpos anti-GFP. Lavar 25 microlitros de proteína A perlas por reacción de inmunoprecipitación con tampón A1 al menos tres veces para eliminar el etanol.
A continuación, haga una solución de 50% de cordón con el búfer A1. Añadir dos microlitros de anticuerpos anti-GFP a las perlas. A continuación, agregue el búfer A1 a 20 veces el volumen neto del cordón. Realice una rotación de extremo a extremo a cuatro grados centígrados durante cuatro a 18 horas.
La duración óptima de la rotación debe determinarse empíricamente en función de la eficiencia de la inmunoprecipitación. Después de la rotación, centrifugar las perlas a 100 veces g durante un minuto y retire el sobrenadante no enlazado. Añadir buffer A1 para hacer una solución del 50% de perlas y utilizar 25 microlitros de esta solución para cada reacción de inmunoprecipitación.
Para realizar la inmunoprecipitación, licenciar las células en el tampón A1 a través de sonicación y congelación/descongelación. Mida las concentraciones de proteínas y normalice las cantidades de proteínas entre las diferentes muestras de IP. A continuación, retire el 5% de la muestra de cada tubo para que se ejecute en la página SDS.
Mezclar el resto del anate con 25 microlitros de proteína A cuentas unidas a anticuerpos anti-GFP y realizar rotación de extremo a extremo a cuatro grados Celsius durante cuatro a 18 horas. Después de la eliminación de las células en el tampón A y la realización de la inmunoprecipitación como se ha descrito anteriormente, mantenga el 10% de los inmunoprecipitantes totales para confirmar la ubiculación EYFP CENP-A y para determinar con precisión la posición de EYFP CENP-A ubiquitida. Utilice el otro 90% para el análisis de espectrometría de masas.
Ejecute la muestra de espectrometría de masas en un gel proteico 4-12%Bis-Tris disponible comercialmente. A continuación, realice la tinción azul de Coomassie e exprima la región de gel de 50-70 kilodalton para el análisis de espectrometría de masas. Corta cada rebanada de gel en trozos pequeños y colólas en un tubo de unión baja a proteínas de 0,5 mililitros.
Lavar las piezas de gel con 100 microlitros de 50% acetonitrilo en bicarbonato de amonio de 25 milimolares. Vórtices durante 10-15 minutos. Luego gírelos hacia abajo y deseche el sobrenadante.
Después del último lavado, seque las piezas de gel con un concentrador de vacío de sobremesa durante 30 minutos. Añadir 10 microlitros de 10 nanogramos por microlitros de grado de secuenciación de microlitros grado trippsina y dejar que las piezas de gel se rehidraten durante cinco minutos. A continuación, añadir 25 bicarbonato de amonio milimolar, lo suficiente para cubrir las piezas de gel y digerir a 37 grados Centígrados durante la noche.
Al día siguiente, transfiera el sobrenadante digerido a un tubo siliconizado limpio de 0,65 mililitros y agregue 50%acetonitrilo y 5% solución de ácido fórmico. Vórtice la muestra durante 10 minutos. A continuación, gire hacia abajo y transfiera el sobrenadante a un tubo de extracción.
Concentre la muestra de nuevo en dos microlitros. A continuación, agregue ocho microlitros de 3%acetonitrilo y 2%solución de ácido fórmico. Vórtice durante 15 minutos y gírtelo a 16.000 veces g durante 30 minutos.
Realice la adquisición de datos MS con LC-MS/MS utilizando un sistema de cromatografía líquida junto con un instrumento de espectrometría de masas. Inyectar ocho microlitros de la muestra en una columna de cromatografía líquida de fase inversa y separar los péptidos con un gradiente de 2-80% de disolvente B en 60 minutos después de las instrucciones del manuscrito. Recopile datos de espectrometría de masas utilizando el modo de adquisición dependiente de datos.
Abra el software comercial para analizar los datos de espectrometría de masas en el escritorio. Para iniciar una nueva búsqueda, haga clic en el botón LC del menú superior. A continuación, haga clic en el botón Agregar para cargar los archivos de datos sin procesar de MS originales.
Seleccione el ID de proteína humana en el método paragon como método de búsqueda de base de datos y busque los archivos de datos sin procesar de MS originales en la base de datos UniProt homo sapiens. Seleccione la trippsina como enzima de digestión y establezca el resto de los parámetros de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Introduzca el nombre de archivo de los resultados y haga clic en el botón Guardar como situado a la derecha del menú.
A continuación, seleccione una carpeta para almacenar los resultados de la búsqueda y haga clic en el botón Guardar. Haga clic en el botón de proceso para iniciar la búsqueda. Una vez finalizada la búsqueda, los datos con el nombre de búsqueda introducido se almacenarán automáticamente en la carpeta seleccionada.
Para obtener los espectros de MS/MS de cualquier péptido específico, abra los resultados de búsqueda en el software F.A continuación, haga clic en la proteína en la lista de proteínas en el menú superior y haga clic en el péptido en el menú central. El MS/MS de este péptido aparecerá en la parte inferior del menú. Para exportar y guardar los espectros de MS/MS, copie los espectros y péguelos en un formato de archivo adecuado.
Las construcciones genéticas de EYFP CENP-A tipo salvaje o mutante K124R que rescata la pérdida de CENP-A endógeno se expresaron de forma estable cuando se realizó la integración retroviral. La expresión de CENP-A endógeno no se detectó siete días después de la inducción de Cre recombinase. Se encontró que tanto el tipo salvaje EYFP CENP-A como la expresión de proteína K124R estaban en un nivel similar a la proteína CENP-A endógena inicial.
Tanto los mutantes EYFP CENP-A como los mutantes K124R mostraron localización de centromere a los siete días después de la interrupción de la expresión restante de CENP-A endógeno. El tipo salvaje EYFP CENP-A y el mutante K124R mostraron ubiquitylation e interacción con HJURP a diferencia del caso para el tipo salvaje CENP-A marcado o sin etiquetar y el mutante K124R. La viabilidad celular se evaluó realizando el ensayo de crecimiento de la colonia 14 días después de la interrupción del alelo cenp-A endógeno restante.
Tanto los mutantes EYFP CENP-A como los mutantes K124R mostraron un número similar de colonias rescatadas 14 días después de la interrupción del alelo cenp-A endógeno restante. La espectrometría de masas IP reveló la ubiculación a la lisina 306 en EYFP CENP-A K124R en células CENP-A menos F. En conjunto, estos resultados sugirieron que la fusión de proteína de gran tamaño induce la ubiculación a una lisina distinta de K124R en CENP-A que inhibe el fenotipo mutante único K124R original.
Al intentar este protocolo, utilice los geles de proteína 4%12%Bis-Tris disponibles comercialmente para ejecutar las muestras de espectrometría de masas. Añadir la tripina adecuada a las piezas de gel y rehidratarlas hasta que todas las enzimas hayan sido absorbidas. En realidad, se requiere una técnica de etiquetado o sondeo de menor peso molecular para visualizar la ubiculación e investigar la señalización de la ubicuación de proteínas temporales espaciales a niveles y a niveles completos del organismo.
