Usando este protocolo, las formas ubiquitinadas de una proteína dada pueden purificarse eficientemente a partir de células de mamíferos, facilitando estudios sobre el papel de la ubiquitinación en la regulación de la función de las proteínas. La purificación de proteínas ubiquitinadas en células de mamíferos en comparación con la purificación in vitro mantiene el modo de enlace de ubiquitina de las proteínas diana en condiciones más radiológicas. Comience agregando 1.5 mililitros de medio sérico reducido en tres tubos de centrífuga de 15 mililitros.
Agregue ADN plásmido listo para la transfección a cada tubo y agregue 0.2 microgramos de plásmido de proteína fluorescente verde para monitorear la eficiencia de la transfección. Agregue 78 microlitros de reactivo de transfección de liposomas a 4,5 mililitros de medio sérico reducido en otro tubo de centrífuga para diluir los liposomas. Mezcle bien moviendo el tubo y luego déjelo reposar durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Agregue 1,5 mililitros de la solución liposomal diluida en cada tubo que contenga 1,5 mililitros de la solución de ADN diluida. Mezcle bien y entregue los plásmidos con los liposomas durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente. Deseche el medio original de las placas de Petri y agregue nueve mililitros del medio sérico reducido en cada plato.
Agregue tres mililitros de la mezcla de ADN liposomático y mezcle la solución agitando suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás tres veces y luego hacia la izquierda y hacia la derecha tres veces para una distribución uniforme de la mezcla en la placa. Cultive las células en la incubadora humidificada a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Reemplace el medio después de cuatro a seis horas y continúe cultivando las células durante 24 a 36 horas.
Después de 24 a 36 horas, tratar las células con MG132 a una concentración final de 10 micromolares durante cuatro a seis horas. Deseche el medio y lave las celdas dos veces con PBS helado. Agregue un mililitro de PBS al plato.
Retire las células raspándolas con un raspador limpio y transfiera la suspensión celular a tubos de microcentrífuga. Centrifugar a 700 G durante cinco minutos para recoger los gránulos celulares. Agregue 800 microlitros del tampón de lisis FLAG helado complementado con un cóctel inhibidor de la proteasa a las células de cada tubo.
Mezcle las células con un oscilador de vórtice o una pistola de pipetas y luego incube la mezcla en un rotador a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Ultrasonicar la mezcla en el hielo con cada pulso que dura un segundo, y someter la mezcla a cinco a 10 pulsos breves. Incubar la mezcla en un rotador a 40 RPM durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.
Luego centrifugar las muestras ultrasónicas a 8, 000 G durante 20 a 30 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. Alícuota 80 microlitros del extracto celular y mezclar con 20 microlitros de tampón de carga 5X SDS.
Hervir las muestras a 98 grados centígrados durante cinco minutos. Enfríe en hielo durante dos minutos y guárdelo a menos 20 grados centígrados hasta que lo use. Utilice estas muestras como grupo de entrada para controlar la expresión de proteínas.
A continuación, agregue 30 microlitros de las perlas conjugadas de anticuerpos anti-FLAG M2 a los extractos celulares restantes e incube en un rotador a cuatro grados centígrados durante al menos cuatro horas o durante la noche. Centrifugar a 1.500 G durante dos minutos a cuatro grados centígrados para recoger las cuentas. Agregue un mililitro del tampón de lisis FLAG helado a las perlas y mezcle invirtiendo el tubo varias veces.
Repita este paso de cuatro a seis veces, luego agregue 40 microlitros de los péptidos FLAG a una concentración final de 200 nanogramos por microlitro a las perlas. Incubar en un rotador durante dos horas como se mostró anteriormente y luego centrifugar a la misma temperatura. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga y agregue 10 microlitros de tampón de carga 5X SDS.
Hervir la mezcla a 98 grados centígrados durante cinco minutos y luego enfriarla en hielo durante dos minutos. Agregue un mililitro de PBS helado a los gránulos de celda y mezcle uniformemente. Alícuota 100 microlitros de la suspensión celular en un tubo de microcentrífuga como muestra de entrada y centrifugar a 700 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para recoger los gránulos celulares.
Agregue 80 microlitros de tampón de lisis FLAG a la muestra de entrada y mezcle las células con un oscilador de vórtice como se mostró anteriormente. Lise las células en hielo durante una hora y luego centrifugar nuevamente durante 20 a 30 minutos. Después de la centrifusión, alícuota 80 microlitros del sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga y agregue 20 microlitros de tampón de carga 5X SDS al sobrenadante.
Hervir la mezcla a 98 grados centígrados durante cinco a 10 minutos y luego enfriar en hielo durante dos minutos. Centrifugar los 900 microlitros restantes de la suspensión celular a 700 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para recoger el pellet celular. Agregue un mililitro de tampón de ubiquitina 1 a los gránulos celulares y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces para distribuir las células de manera uniforme.
Someter los lisados celulares a 10 a 20 rondas de ultrasonido en hielo hasta que la solución ya no sea viscosa, y luego centrifugar la solución. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga y agregue 30 microlitros de resina cargada de níquel al sobrenadante. Incubar en un rotador a 15 RPM durante cuatro horas o durante la noche a temperatura ambiente y luego centrifugar durante dos minutos.
Después de la centrifusión, recoja las perlas y agréguele un mililitro de tampón de ubiquitina 1. Incubar con rotación en una coctelera durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego centrifugar de nuevo a 1.500 G durante dos minutos, como se mostró anteriormente. Agregue un mililitro de tampón de ubiquitina 2 a las perlas y realice la incubación seguida de centrifugación, como se mostró anteriormente, para recolectar las perlas.
Repita este paso una vez. A continuación, agregue un mililitro de PBS a las perlas y siga el mismo procedimiento de incubación y centrifugación para recoger las perlas. Repita este paso una vez más.
Eluyó las proteínas unidas incubando las perlas con 40 microlitros de imidazol a una concentración final de 0,5 molares durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, centrifugar nuevamente a 1, 500 G durante dos minutos. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio y agregue 10 microlitros de tampón de carga 5X SDS.
Hervir la solución a 98 grados centígrados durante cinco minutos y luego enfriarla en hielo durante dos minutos. Resuelva las muestras por SDS-PAGE y luego transfiéralas a una membrana de nitrocelulosa mediante Western blot para detectar proteínas diana utilizando los anticuerpos correspondientes. Inicie el sistema de imágenes de quimioluminiscencia para detectar señales de Western blotting.
Coloque la membrana de nitrocelulosa en la cámara oscura boca arriba. Codifique la solución de sustrato uniformemente en la membrana con una pipeta. Finalmente, seleccione el procedimiento de exposición automática para capturar las señales quimioluminiscentes y ajuste manualmente el tiempo de exposición hasta que se adquiera una señal ideal.
La proteína p53 total, incluida la p53 ubiquitinada, se inmunoprecipitó con perlas FLAG M2 de células H1299 en condiciones no desnaturalizantes. El eluido fue sometido a western blot con anti p53 y anti hemaglutinina o con anticuerpos anti p53 y monoclonales. Aquí, los extractos de células crudas o la entrada se sometieron a Western blot con anticuerpos monoclonales anti p53 y anti MDM2.
La señal de la proteína p53 ubiquitinada que aparece como una banda manchada de bajo a alto peso molecular aumentó notablemente cuando MDM2 se expresó ectópicamente en estas células. Este resultado sugiere que la proteína p53 ubiquitinada ha sido efectivamente purificada de las células. A continuación, las células se lisaron en condiciones de desnaturalización.
Las proteínas ubiquitinadas celulares totales se retiraron con resina cargada de níquel y luego se sometieron a Western blot con anticuerpos monoclonales anti p53 y antihemaglutinina. La proteína p53 ubiquitinada se detectó utilizando un anticuerpo anti p53 y un anticuerpo anti hemaglutinina. Aquí en las células crudas los extractos o insumos fueron sometidos a western blot con anticuerpos monoclonales anti p53 y anti MDM2.
Los resultados mostraron que el nivel total de proteína ubiquitinada se mantuvo sin cambios, pero el nivel de proteína ubiquitinada p53 aumentó dramáticamente después de que MDM2 se sobreexpresó en estas células. Esto indica que las proteínas ubiquitinas totales que contienen p53 ubiquitinado fueron efectivamente retiradas de los lisados celulares en condiciones de desnaturalización. Al intentar este procedimiento, recuerde tratar las células con MG132 antes de la recolección celular y ultrasonicar las células adecuadamente en hielo para la purificación de proteínas ubiquitinadas.
