Este protocolo es una manera fácil de generar los perfiles de modificaciones post-traduccionales similares a la ubiquitina mediante la identificación y seminificación de proteínas identificadas específicas. La principal ventaja de esta técnica es el uso de lentivirus para crear una línea de expresión celular estable dentro de una semana, y el uso de dos etiquetas para purificar específicamente las proteínas. De hecho, este tipo de modificaciones post-traduccionales están involucradas en la mayoría de las funciones biológicas, y las alteraciones de este mecanismo se encuentran en la mayoría de las enfermedades.
Por lo tanto, la identificación de estas alteraciones puede servir como un pronóstico y / o diagnóstico y, por supuesto, como dianas moleculares. La ubiquitina es una de las proteínas más conservadas en las células eucariotas y esta esencial para su supervivencia. Por lo tanto, este tipo de método podría aplicarse a cualquier modelo eucariota, desde mamíferos hasta levaduras.
Sin embargo, nuestro sistema lentiviral está restringido al estudio de las células. Dado que todo el procedimiento es bastante largo con a veces largo tiempo de incubación, es posible hacerlo durante dos días en lugar de uno. El eluido de las cuentas de níquel se puede congelar en menos 20 y antes de agregar las cuentas de la bandera.
Este protocolo contiene muchos pasos entre los cuales algunos son críticos para garantizar el éxito final de la purificación, y por lo tanto el establecimiento preciso del perfil de modificación post-traduccional. La demostración del procedimiento será realizada por Mirna Swayden y Aurelie Dobric, dos estudiantes de doctorado del laboratorio. Para empezar, agregue 0,5 veces 10 a la sexta de las células HEK 293T en una placa de seis pozos con dos mililitros por pozo de DMEM con 10%FBS a la semilla, e incubar a 37 grados Celsius, 5% dióxido de carbono y 100% de humedad.
Al día siguiente, se logra una confluencia del 50 al 70%. Cotransfect las células con una mezcla de un microgramo de pCCL-6HF similar a la ubiquitina o pCCL-GFP, un microgramo de PBS VG y un microgramo de vectores auxiliares delta utilizando un reactivo de transfección y protocolo para la producción de lentivirus. Después de seis horas de transfección, cambie el medio a uno fresco correspondiente al medio de las células a transducir.
Siembra las células a transducir en una placa de seis pozos con sus medios de cultivo estándar con el fin de obtener 10 a 20% de confluencia el día después. 24 horas después de la transfección, recuperar el medio que contiene partículas lentivirales y filtrar utilizando filtros de 0,45 micras. Sustituya el medio de las células que se van a transducir por el medio filtrado que contiene lentivirus.
Incubar las células con lentivirus durante 24 a 72 horas en una incubadora a 37 grados Celsius y 5%dióxido de carbono, y luego cambiar el medio con uno fresco y estándar. Compruebe la expresión de GFP utilizando un microscopio fluorescente invertido para evaluar la eficiencia de la transducción. Si no se detecta fluorescencia, espere de dos a tres días adicionales.
Si el control de la GFP es positivo con fluorescencia verde, haga crecer todas las células hasta tener suficiente para realizar un control de expresión de 6-His-FLAG similar a la ubiquitina por inmunofluorescencia, como se muestra aquí, y la mancha occidental usando anticuerpo anti-FLAG. Después de cultivar las células en platos de 15 centímetros, lave los platos de cultivo al menos una vez con solución salina tamponada con fosfato a temperatura ambiente. Para comenzar la lelisis celular, agregue dos mililitros de tampón uno en cada plato de 15 centímetros a temperatura ambiente.
Utilice un rascador de células para recuperar todos los lysates en tubos de centrífugo cónico de 50 mililitros. Sonicar los lystates tres veces durante 30 segundos, separados por una pausa de un minuto. Centrifugar los lysates sonicados a 15.000 veces g durante 15 minutos.
Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo a través de un colador celular de 40 micras. Es muy importante filtrar los lysates después de la sonicación y la centrifugación. No hacer esto puede resultar en la copurificación de muchas proteínas no específicas, aumentando así el fondo y reduciendo fuertemente el tamaño del perfil PTM.
Transfiera una cantidad igual de proteína entre 50 y 100 miligramos a los nuevos tubos Falcon. Agregue cuentas NTA de iones de níquel en cada tubo con la cantidad de dos microlitros de cuentas por un miligramo de proteína. Coloque los tubos sobre un rotador para girar a 30 rpm durante 2 horas y media a temperatura ambiente.
A continuación, pele el cordón a 500 veces g durante cinco minutos. Lave las cuentas con un mililitro de tampón uno y transfiera las muestras a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Coloque el tubo sobre hielo.
Lavar dos veces con un mililitro de tampón helado dos que contengan imidazol de diez mililitrolares. Para elit-bound proteínas, añadir 600 microlitros de tampón dos que contienen imidazol 250 mililitros, y rotar durante dos horas a cuatro grados Centígrados. Después de peletizar las perlas por centrifugación a 500 veces g durante un minuto, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo pre-enfriado de 1,5 mililitros, y agregue 50 microlitros de perlas conjugadas con anticuerpos anti-FLAG M2.
Gire a 30 rpm durante 2 horas y media a cuatro grados centígrados. A continuación, lave dos veces con 500 microlitros de tampón dos, luego dos veces con 500 microlitros de tampón tres. Para la elución final, agregue 100 microlitros de tampón tres que contengan un péptido FLAG a 0,01 microgramos por microlitro, y gire a cuatro grados centígrados durante 1 1/2 horas.
Después de la centrifugación a 500 veces g durante un minuto, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo preenfriado. Tome 10 microlitros para cargar en SDS-PAGE, y realizar una tinción de plata del gel para controlar la calidad de purificación. Si la purificación se ve bien, analice el 90% dejado por LC-MS.
Para realizar la normalización, utilice las fórmulas para normalizar los valores entre las células tratadas con fármacos y las células no tratadas para la ubiquitina y la GFP. Para eliminar el fondo, reste los valores de la GFP de la muestra de control de los valores de las muestras de ubiquitina, para obtener valores específicos para cada proteína identificada en ambas condiciones. Para obtener la variación de la ubiquitinación, obtener una puntuación entre menos 100 y más 100 para variaciones positivas y negativas de LAS PTM inducidas por un medicamento.
La diferencia entre los valores específicos de las muestras tratadas y no tratadas se divide por la suma de todos los valores, incluidos los del control, y se multiplica por 100. Las variaciones inferiores a menos 50, que representan la represión de la PTM, o superiores a 50, que representan la inducción de la PTM, se consideran significativas. Utilice esta fórmula para obtener un valor de confianza entre cero y 100%Los valores por encima de 50 generalmente se consideran seguros.
Para obtener una mejor distribución de los valores de inducción y represión, y para considerar los parámetros de variación y confianza, utilice esta fórmula para multiplicar los valores de varianza y confianza. En este estudio, se logró la transducción de células de mamíferos de cultivo para crear células expresantes de ubiquitina GFP y 6-histidina FLAG. La eficacia de la transducción lentiviral se controló primero examinando la fluorescencia GFP de las células transducidas por GFP.
La expresión de FLAG-ubiquitina se realizó mediante la tinción por inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-FLAG, que muestra el porcentaje de células transducidas. Con el fin de controlar el nivel de expresión de FLAG-ubiquitina exógena, los lysates de las células transducidas fueron analizados por SDS-PAGE seguido de mancha occidental con anticuerpo anti-FLAG. Después de la purificación de las proteínas ubiquitinadas, el 10% de la elución final se utilizó para controlar la cantidad e integridad del material purificado por SDS-PAGE y la tinción de plata del gel.
La resta de muestras de GFP de fondo identificó 364 proteínas significativamente ubiquitinadas con una puntuación superior al 50%A del gen conjunto de análisis de enriquecimiento de estas proteínas ubiquitinadas se realizó con el fin de resaltar los procesos biológicos en los que estaban involucradas. Posibles redes de interacción formadas por alteraciones de la ubiquitinación inducidas por gemcitabina. Esto condujo a la identificación de redes funcionales de interacción fuertemente afectadas por el aumento o disminución de la ubiquitinación de las proteínas involucradas.
También se confirmó que la ubiquitinación de PCNA aumentó después del tratamiento con gemcitabina. Es muy importante evitar la transferencia de algunas cuentas después de ambos pasos de elución, ya que puede resultar en un aumento significativo del fondo. Este procedimiento generará modificaciones post-traduccionales específicas que, comparando diferentes condiciones, permitirán la identificación de alteraciones específicas.
El primer paso siguiente será validar al menos las alteraciones de interés basadas en enfoques bioquímicos. Desarrollamos este método para explorar modificaciones post-traduccionales basadas en ubiquitina con el fin de identificar nuevas formas y mecanismos de las células cancerosas pancreáticas. Desde este protocolo y otros desarrollados en todo el mundo se han empleado con éxito para descifrar diferentes procesos biológicos.
Los lentivirus deben utilizarse al menos en laboratorio BL-2. Guanidine es un agente desnatural. El sonicador también puede ser perjudicial para los oídos y tiene que ser utilizado siguiendo las recomendaciones.
