Este protocolo describe la novedosa técnica para el enriquecimiento simultáneo de múltiples PTM con anticuerpos seguido de análisis de espectrometría de masas de adquisición independiente de datos para obtener información biológica sobre la localización del sitio y la conversación cruzada. Esta es una técnica rentable y de tiempo que permite la identificación y cuantificación simultánea de péptidos con corte que contiene acetilación y SPM de sucinilación con sólo pequeñas cantidades de entrada de muestra. El seguimiento de las modificaciones post-traduccionales es un paso importante para caracterizar y combatir los diferentes estados de la enfermedad.
Ya somos conscientes de que ciertos tipos de cáncer y diabetes están altamente regulados a través de estas modificaciones de proteínas. Este método puede aplicarse teóricamente a cualquier PTM con anticuerpos para el enriquecimiento como la ubiquitinación, la fosforilación y otros. También se puede aplicar a otros tipos de tejido o modelos de cultivo celular.
La clave para obtener datos valiosos utilizando esta técnica es la reproducibilidad. Esto se puede lograr asegurando que todos los pasos se realicen con mucho cuidado, particularmente los pasos que implican las perlas de anticuerpos. Para empezar, obtenga cartuchos que contengan resina C18 que combinen hasta 10 miligramos de proteína.
Coloque estos cartuchos en un aparato de vacío. Agregue 800 microlitros de 80%acetonitrilo y 0,2% de ácido fórmico a los cartuchos con 19,8% de agua e inicie la succión al vacío para extraer el líquido. Repita este paso una vez evitando el secado de los cartuchos por completo.
Equilibre los cartuchos añadiendo 800 microlitros de 0,2% de ácido fórmico en agua con aspiración al vacío. Repite esto dos veces. Cargue un miligramo de péptidos en aproximadamente 1.000 microlitros de solución en los cartuchos con aspiración al vacío.
Lavar los péptidos dos veces con 800 microlitros de ácido fórmico del 0,2% en agua bajo aspiración al vacío. A continuación, coloque tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros debajo de cada cartucho para recoger el péptido. Bajo succión al vacío, eluir los péptidos de los cartuchos primero con 800 microlitros de 80%acetonitrilo y 0,2% de ácido fórmico en 19,8% de agua y luego con 400 microlitros de la misma solución.
Seque las muestras de péptidos desaladas completamente en un concentrador de vacío durante dos a tres horas. Ahora, resuspender los péptidos secos en 1,4 mililitros de tampón frío de purificación de inmunoafinidad 1X. Vórtice para mezclar y asegurar un pH de aproximadamente 7.
Centrifugar las muestras a 10.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Aparece un pequeño pellet. Deja los péptidos a un lado sobre hielo mientras preparas las cuentas de anticuerpos.
Añadir un mililitro de PBS frío 1X a un tubo que contenga 100 microlitros de lodo de cordón de anticuerpos K-acetil y un tubo que contenga 100 microlitros de lodo de cordón de anticuerpos K-succinyl y mezclar por pipeteo. Transfiera toda la solución a nuevos tubos de 1,5 mililitros y gire en una centrífuga en miniatura durante 30 segundos a temperatura ambiente. Aspirar el PBS teniendo cuidado de evitar aspirar de cualquier perla.
Repita el lavado tres veces más. A continuación, resuspender las cuentas en aproximadamente 440 microlitros de PBS. Pipetear las cuentas varias veces para mezclar bien.
Con 200 puntas precortados de microlitros, transfiera 100 microlitros de cada perla de anticuerpos de acetilllysina y perlas de anticuerpos sucinillysina a un nuevo tubo. Gire hacia abajo durante 30 segundos en una centrífuga en miniatura y aspire fuera de los medios con una punta de cargador de gel. Las cuentas ahora se vuelven blancas.
Pipetear el péptido resuspendido directamente sobre las cuentas lavadas e incubar los péptidos con cuentas a cuatro grados Celsius durante la noche con agitación. Por la mañana, gire las muestras de péptidos a 2.000 g durante 30 segundos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante que contiene péptidos no enlazados y guárdelo para futuros experimentos si lo desea.
Agregue un mililitro de tampón frío de purificación de inmunoafinidad 1X a las perlas para lavar y mezclar invirtiendo cinco veces. Gira a 2.000 veces g durante 30 segundos a cuatro grados centígrados. Aspirar la solución de purificación de inmunoafinidad y repetir el paso de lavado de purificación de inmunoafinidad una vez más.
A continuación, agregue un mililitro de agua HPLC fría a las perlas y mezcle invirtiendo cinco veces. Gira a 2.000 veces g durante 30 segundos a cuatro grados centígrados. Aspirar el agua y repetir el paso de lavado de agua dos veces más.
Gire un tiempo adicional a 2.000 veces g durante 30 segundos a cuatro grados centígrados para recoger el agua restante en la parte inferior del tubo. Con las puntas de carga de gel de punta plana, aspira cualquier agua extra que se haya acumulado. Tenga cuidado de no aspirar las cuentas.
Añadir 55 microlitros de 0,15%ácido trifluoroacético en agua a las perlas. Incubar las perlas durante 10 minutos a temperatura ambiente mientras ocasionalmente toca la parte inferior del tubo para mezclar. Gire las cuentas a temperatura ambiente durante 30 segundos en una centrífuga en miniatura.
Utilice una punta de carga de gel de punta plana para transferir los péptidos eluidos a un tubo nuevo. Añadir 45 microlitros de 0,15%ácido trifluoroacético en agua a las perlas. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente mientras se toca la parte inferior del tubo de vez en cuando para mezclar.
Gire las cuentas a temperatura ambiente durante 30 segundos en la centrífuga en miniatura. Retire la segunda elución con una punta de carga de gel de punta plana y combínela con la primera elución. Gire los péptidos eluidos combinados a 12.000 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente para peletizar cualquier perla que se transporte.
Transfiera la solución de muestra de péptido a un nuevo tubo de 500 microlitrotros. Construir el método de carga para cargar las mezclas de péptidos enriquecidos en un chip de precolumna C18 y desalgar los péptidos de nuevo mediante el lavado con fase móvil A a dos microlitros por minuto durante 10 minutos. Construir el método de cromatografía de tal manera que los péptidos se transfieran a una columna analítica y eluden a un caudal de 300 nanolitros por minuto con un gradiente de dos a tres horas utilizando las fases móviles A y B.Específicamente, utilice un gradiente lineal de 5%fase móvil B a 35%fase móvil B durante 80 minutos.
Posteriormente, el aumento de la fase móvil B al 80% durante cinco minutos y luego se mantenga en 80%B durante ocho minutos antes de volver al 5%B para un reequilibramiento de 25 minutos. A continuación, cree un método de instrumento MS para la adquisición dependiente de datos. Para el experimento uno, configure el escaneo de iones precursores MS1 de M/Z 400 a 1,500.
Establezca la duración en 120 minutos. Cree un experimento de IDA y haga clic en Aceptar. En la pestaña Criterios de conmutación, establezca el umbral de intensidad para activar los exámenes MS/MS para iones de estados cargados entre dos y cinco a 200 recuentos por segundo. Establezca la exclusión dinámica de iones precursores en 60 segundos.
Para el experimento dos, establezca el escaneo de iones de productos MS/MS con un rango de exploración MS2 de M/Z 100 a 1.500. Haga clic en Editar parámetros y establezca la dispersión de energía de colisión en cinco y seleccione el modo de escaneo de iones de producto de alta sensibilidad. Por último, coloque la muestra en el muestreador automático.
Envíe la cola de ejemplo e inicie los métodos de adquisición de LC-MS/MS creando un método de instrumento MS para la adquisición independiente de datos y definiendo dos experimentos de análisis de instrumentos. Realice escaneos de iones precursores MS1 de 400 a 1, 250 de masa para cargar y establezca la duración en 120 minutos. Establezca la dispersión de energía de colisión en 10 y el tiempo de acumulación en 45 milisegundos y, a continuación, seleccione el modo de escaneo de iones de producto de alta sensibilidad.
A continuación, importe un archivo de texto que contenga el esquema de adquisición DE 64 variables de DIA SWATH para rellenar ventanas de adquisición DE SWATH en el método. En este esquema de adquisición, las ventanas variables que van de cinco a 90 masa a carga y anchura se pasan en pasos incrementales en el rango de masa completo de 400 a 1, 250 de masa para cargar con un total de 64 segmentos SWATH cada uno con un tiempo de acumulación de 45 milisegundos. Ajuste el tiempo de acumulación de MS1 a 0,25 segundos.
Juntos, el escaneo MS1 y 64 escaneos MS2 ahora deberían producir un tiempo de ciclo total de 3,2 segundos. En este estudio, los resultados experimentales documentaron la posibilidad de detectar y evaluar las conversaciones cruzadas de PTM. Esta tabla muestra cómo la línea de tiempo del flujo de trabajo y las cantidades de muestra y proteína necesarias.
El método de una olla se puede realizar en la mitad de tiempo y con la mitad del número de muestras que estos métodos alternativos. El coeficiente medio de variación para las áreas de péptidos modificados fue menor en el método de una olla que en el enriquecimiento único de PTM y PTM serie. Al comparar los métodos de enriquecimiento de PTM de una olla y de PTM único, no se observaron diferencias notables entre las correlaciones de cuantificación a nivel de sitio para las dos modificaciones.
Esta figura muestra los datos de un enriquecimiento exitoso e ilustra un ejemplo para un péptido que contiene múltiples y diferentes modificaciones de acil visualizando la conversación cruzada PTM. Un péptido fue acetilado en un residuo de lisina y succilynated en el otro mientras que aquí el mismo péptido fue succilynated en ambas lisinas. Esto demuestra que el mismo residuo de lisina puede ser modificado con ambos grupos de acilación y existe la posibilidad de que se produzca una conversación cruzada en ese sitio.
Es esencial asegurarse de que cada muestra contiene la misma cantidad de cuentas y asegurarse de que ninguna de las cuentas se aspira accidentalmente al lavar las cuentas de unión de péptidos. La generación de perfiles y el análisis de datos basados en espectrometría de masas en herramientas de software como Spectronaut se realizan siguiendo este procedimiento para identificar, cuantificar y realizar la localización del sitio de las PTM. Este flujo de trabajo de adquisición independiente de datos en combinación con el enriquecimiento simultáneo de PTM abrirá vías para evaluar de manera más eficiente las conversaciones cruzadas de PTM y proporcionar una mejor información sobre la relevancia de la señalización PTM.
