La retinopatía diabética es la complicación microvascular más común de la diabetes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la fisiopatología de la retinopatía diabética proliferativa de la enfermedad terminal. Esta técnica permite la deconstrucción del paisaje de tejido tridimensional nativo y la investigación de la fisiopatología tisular en material vivo del paciente con relevancia clínica directa. Consulte el protocolo de texto para obtener detalles sobre la cirugía y la instrumentación utilizada en la disección. Para empezar, coloque el tejido fibrovascular que ha sido extirpado de sujetos humanos sometidos a cirugía vitreorretiniana de microincisión transconjuntival en un plato de cultivo celular que contenga PBS estéril. Usando un microscopio estéreo de disección vertical, corte el tejido fibrovascular en aproximadamente un milímetro cuadrado. Sumerja el tejido en PBS y mantenga el tejido en su lugar con pinzas de micro disección. Haz cortes claros en el tejido con un bisturí estéril teniendo cuidado de evitar rasgar el tejido fibrovascular. Coloque cada pieza individual de tejido en un pozo de una placa de cultivo celular de 12 pozos que contenga un mililitro de PBS estéril. En primer lugar, preparar 25 microlitros alícuotas de solución de fibrinógeno a temperatura ambiente. Coloque una pieza de tejido fibrovascular en el centro del pozo de una placa de 24 pozos y retire cualquier exceso de PBS. A continuación, añada 25 microlitros de solución ta a una de las alícuotas de fibrinógeno preparadas. Y usando otra pipeta ajustada a 50 microlitros se mezclan por pipeteo. Dispensar la mezcla sobre la pieza de tejido fibrovascular y pipeta hacia arriba y hacia abajo para asegurar que la pieza de tejido está contenida dentro de la gota. El tiempo de formación de fibrinógeno crítico para la tridimensionalidad del cultivo ex vivo, se prueba en una gota vacía de incrustación de tejido anterior como se describe en el protocolo. Incubar la placa en una incubadora de cultivo celular. Después de 30 a 60 minutos inclinar la placa para comprobar que el gel de fibrina está completamente formado. A continuación, superponer los geles de fibrina de tejido fibrovascular con medio de cultivo ex vivo complementado con aprotinina. Después de esto, devuelva las placas de cultivo a la incubadora de cultivo celular para el período de tiempo deseado. En primer lugar, reemplace el medio de cultivo ex vivo con un mililitro de solución de paraformaldehído por pozo para fijar los cultivos. Después de una hora, enjuague los geles con tres lavados PBS de cinco minutos. A continuación, reemplace el lavado PBS por dos mililitros de solución de azida sódica por pozo. Almacene los geles fijos a cuatro grados Celsius.Use una espátula de borde cuadrado de acero inoxidable para levantar las gotas de la placa con cuidado, comenzando en los bordes antes de levantar el centro de la gota. Usando una espátula de borde redondo transfiera las gotas a pozos individuales de una placa de 12 pozos que contiene un mililitro de PBS. Después de esto, incline la placa sobre un soporte y coloque las gotas con un mililitro de solución de metanol de acetona helada durante un minuto. Luego, enjuague con tres a cinco lavados de dos mililitros de PBS. Centrifugar la solución de bloqueo durante 15 minutos para eliminar los residuos. A continuación, incline la placa sobre un soporte e incubar las gotas en 500 microlitros de solución de bloqueo durante dos horas a temperatura ambiente. Preparar la mezcla de anticuerpos primarios de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, utilice una espátula de borde redondo para transferir las gotas a una placa redonda inferior de 96 pozos. Incubar las gotas en 30 microlitros de mezcla de anticuerpos primarios por gota durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, transfiera las gotas a una placa de 12 pozos que contenga dos mililitros de solución de lavado por pozo. Enjuague las gotas con tres lavados de cinco minutos. Luego, lave las gotas con nueve lavados de 30 minutos. Al día siguiente, enjuague las gotas tres veces con PBS. Preparar la mezcla de anticuerpos secundarios conjugada con fluoróforo adecuada de acuerdo con el protocolo de texto. Transfiera las gotas a una placa redonda inferior de 96 pozos, como se ha demostrado anteriormente, e incubar la placa con 30 microlitros de mezcla de anticuerpos secundarios durante cuatro horas a temperatura ambiente, protegidos de la luz.Después de cuatro horas, transfiera las gotas a una placa de 12 pozos que contenga dos mililitros de solución de lavado por pozo. Primero, enjuague las gotas con tres lavados de cinco minutos. A continuación, lave las gotas con cuatro lavados de 30 minutos. Al día siguiente, enjuague las gotas cinco veces con solución de lavado durante 30 minutos, y tres veces con PBS durante 30 minutos. Al día siguiente, transfiera las gotas a una placa redonda inferior de 96 pozos, como se ha demostrado anteriormente. Contraataque las gotas con mancha nuclear Hoechst durante 30 minutos a temperatura ambiente. Transfiera las gotas a una placa de 12 pozos que contenga dos mililitros de PBS por pozo y enjuague tres veces con PBS. A continuación, aplique una capa estrecha de medio de montaje de endurecimiento rápido a lo largo de los bordes de un vidrio de cubierta cuadrada y deje que se seque durante un minuto. A continuación, enjuague la gota sumergiéndola en un pozo de un recipiente de 12 pozos que contenga agua desionizada. Y transfiera la gota a una diapositiva del microscopio. A continuación, dispensar 15 microlitros de medio de montaje anti-fade no endurecido en la gota. Coloque suavemente el cristal de la cubierta sobre la gota con el medio de montaje mirando hacia el portaobjetos y déjelo asentar. Deje que los portaobjetos se sequen durante dos horas a temperatura ambiente y guárdelos a cuatro grados centígrados durante la noche. Por último, imagine las diapositivas con un microscopio de epifluorescencia vertical equipado con una función de seccionamiento óptico con objetivo de 20x o 40x. En este protocolo se preparó e probó el tejido fibrovascular. Los datos representativos mostraron que las culturas de PDR ex vivo inducen la brotación del endotelio positivo CD-31 y la preservación de la vasculatura en respuesta a VEGFA. Por el contrario, TGF
