La retinopatia diabetica è la complicanza microvascolare più comune del diabete. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla fisiopatologia della retinopatia diabetica proliferativa della fase finale. Questa tecnica consente la decostruzione del paesaggio tissutale tridimensionale nativo e l'indagine della fisiopatologia tissutale in materiale paziente vivo con rilevanza clinica diretta. Fare riferimento al protocollo di testo per i dettagli sull'intervento chirurgico e sulla strumentazione utilizzata nella dissezione. Per iniziare, posizionare il tessuto fibrovascolare che è stato asportato da soggetti umani sottoposti a chirurgia vitreoretinica di microincisione transcongiuntivale in un piatto di coltura cellulare contenente PBS sterile. Utilizzando un microscopio stereo a dissezione verticale, tagliare il tessuto fibrovascolare in circa un millimetro quadrato. Immergere il tessuto in PBS e tenere il tessuto in posizione con pinzette a micro dissezione. Effettuare tagli chiari nel tessuto con un bisturi sterile facendo attenzione a evitare di strappare il tessuto fibrovascolare. Mettere ogni singolo pezzo di tessuto in un pozzo di una piastra di coltura cellulare di 12 pozzetti contenente un millilitro di PBS sterile. In primo luogo, preparare 25 aliquote microliter di soluzione di fibrinogeno a temperatura ambiente. Posizionare un pezzo di tessuto fibrovascolare al centro del pozzo di una piastra di 24 pozzetti e rimuovere eventuali PBS in eccesso. Aggiungere quindi 25 microlitri di soluzione TA a una delle aliquote fibrinogene preparate. E usando un'altra pipetta impostata su 50 microlitri mescolare con pipettazione. Erogare la miscela sul pezzo di tessuto fibrovascolare e pipetta su e giù per assicurare che il pezzo di tessuto sia contenuto all'interno della goccia. Il tempo di formazione del fibrinogeno critico per la tridimensionalità della coltura ex vivo, viene testato in una goccia vuota che incorpora il tessuto precedente come descritto nel protocollo. Incubare la piastra in un incubatore di coltura cellulare. Dopo 30-60 minuti inclinare la piastra per verificare che il gel di fibrina sia completamente formato. Successivamente, sovrapporre i gel di fibrina del tessuto fibrovascolare con mezzo di coltura ex vivo integrato con aprotinina. Successivamente, restituire le piastre di coltura all'incubatore di coltura cellulare per il periodo di tempo desiderato. In primo luogo, sostituire il mezzo di coltura ex vivo con un millilitro di soluzione di paraformaldeide per pozzo per fissare le colture. Dopo un'ora, sciacquare i gel con tre lavaggi PBS di cinque minuti. Quindi, sostituire il lavaggio PBS con due millilitri di soluzione di azide di sodio per pozzo. Conservare i gel fissi a quattro gradi Celsius.Utilizzare una spatola di bordo squadrata in acciaio inossidabile per sollevare attentamente le goccioline dalla piastra, a partire dai bordi prima di sollevare il centro della goccia. Utilizzando una spatola rotonda bordata trasferire le goccioline in singoli pozzi di una piastra di 12 pozzetti contenente un millilitro di PBS. Successivamente, inclinare la piastra su un supporto e postfissare le goccioline con un millilitro di soluzione di metanolo acetone ghiacciato per un minuto. Quindi, sciacquare con tre o cinque due lavaggi millilitro di PBS. Centrifugare la soluzione di blocco per 15 minuti per rimuovere eventuali detriti. Quindi, inclinare la piastra su un supporto e incubare le goccioline in 500 microlitri di soluzione di blocco per due ore a temperatura ambiente. Preparare la miscela di anticorpi primari secondo il protocollo di testo. Quindi utilizzare una spatola rotonda bordata per trasferire le goccioline su una piastra rotonda inferiore di 96 poggiasto. Incubare le goccioline in 30 microlitri di miscela di anticorpi primari per goccia durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, trasferire le goccioline su una piastra di 12 po 'contenente due millilitri di soluzione di lavaggio per pozzo. Risciacquare le goccioline con tre lavaggi di cinque minuti. Quindi, lavare le goccioline con nove lavaggi di 30 minuti. Il giorno seguente, sciacquare le goccioline tre volte con PBS. Preparare l'appropriata miscela di anticorpi secondari coniugati con fluorofore secondo il protocollo di testo. Trasferire le goccioline su una piastra rotonda inferiore di 96 po', come precedentemente dimostrato, e incubare la piastra con 30 microlitri di miscela anticorpale secondaria per quattro ore a temperatura ambiente, protetta dalla luce.Dopo quattro ore, trasferire le goccioline in una piastra di 12 pozza di pozzo contenente due millilitri di soluzione di lavaggio per pozzo. Per prima cosa, sciacquare le goccioline con tre lavaggi di cinque minuti. Quindi, lavare le goccioline con quattro lavaggi di 30 minuti. Il giorno successivo, sciacquare le goccioline cinque volte con la soluzione di lavaggio per 30 minuti e tre volte con PBS per 30 minuti. Il giorno successivo, trasferire le goccioline su una piastra rotonda inferiore di 96 po ', come precedentemente dimostrato. Controsostenere le goccioline con macchia nucleare hoechst per 30 minuti a temperatura ambiente. Trasferire le goccioline su una piastra di 12 po porsi contenente due millilitri di PBS per pozzo e risciacquare tre volte con PBS. Quindi, applicare uno strato stretto di mezzo di montaggio indurente rapido lungo i bordi di un vetro di copertura quadrato e lasciare asciugare per un minuto. Quindi, sciacquare la goccia immergerla in un pozzo di un piatto di 12 po 'contenente acqua deionizzata. E trasferire la goccia su una diapositiva al microscopio. Successivamente, erogare 15 microlitri di mezzo di montaggio anti-dissolvenza non indurente sulla goccia. Posizionare delicatamente il vetro di copertura sopra la goccia con il mezzo di montaggio rivolto verso lo scivolo e lasciarlo depositare. Lasciare asciugare gli scivoli per due ore a temperatura ambiente e conservarli a quattro gradi Celsius durante la notte. Infine, immagini le diapositive con un microscopio a epifluorescenza verticale dotato di una funzione di sessatura ottica con obiettivo 20x o 40x. In questo protocollo il tessuto fibrovascolare è stato preparato e immaginato. I dati rappresentativi hanno dimostrato che le colture ex vivo PDR inducono la germogliazione dell'endotelio positivo CD-31 e la conservazione della vascuola in risposta al VEGFA. Al contrario, TGF
