Aquí, mostramos cómo construir una cámara de estimulación eléctrica utilizando seis placas comunes de cultivo de pared, y cómo usarla para estimular la diferenciación osteogénica en células madre mesenquimales. Esta cámara es fácil y no costosa de construir, y se puede reutilizar en múltiples experimentos. Después de ser pretratado con estimulación eléctrica en nuestra cámara, las células madre mesenquimales se pueden utilizar para mejorar los resultados en los tratamientos de ingeniería de tejido óseo.
Esta cámara también se puede utilizar para investigar otros tipos de células y comportamientos celulares electrosensibles como la migración, la proliferación, los cambios en el potencial de la membrana, la apoptosis y la fijación cuidadosa. En una tapa de placa de seis pozos, marque y luego taladre dos agujeros de un milímetro de diámetro, separados por 25 milímetros, cerca del borde exterior de cada uno de los seis pozos. A continuación, corte un alambre de platino en secciones de 12 cinco centímetros de largo.
Dobla manualmente cada sección de cinco centímetros en forma de L, dejando un extremo de tres centímetros de largo, y los otros dos centímetros de largo. Luego, corte el alambre recubierto de plata en dos longitudes de 35 centímetros. Inserte el extremo doblado más largo de un alambre de platino en el agujero perforado, dejando de uno a dos milímetros sobresaliendo del exterior de la tapa.
Doblarlo usando fórceps. Después, fije los cables de platino en los orificios de la tapa con pegamento superconductor y déjelos secar durante aproximadamente seis horas. Para preparar los cátodos, suelde las puntas de los seis cables de platino que sobresalen de la tapa a uno de los cables recubiertos de plata.
Para preparar los ánodos, suelde los seis alambres de platino restantes a otros cables recubiertos de plata. Posteriormente, agregue LED en el circuito entre cada uno de los seis pares de platino-electrodo de ánodo-cátodo para confirmar la funcionalidad. Coloque un pedazo de cinta de aislamiento negro debajo de cada LED para evitar exponer las células de las placas de cultivo a la luz LED.
A continuación, pegue el conector del bloque de terminales de alambre a la esquina superior izquierda de la tapa de la placa de seis pozos y conecte ambos cables recubiertos de plata a los terminales de entrada. A continuación, corte una sección cuadrada de 20 milímetros por 20 milímetros de la esquina superior izquierda de una segunda tapa de placa de seis pozos, para acomodar el conector de bloque de terminales en la primera tapa. Cubra la primera tapa, equipada con los electrodos, con la segunda tapa, y fíbralos junto con cinta adhesiva.
Conecte un extremo de los dos cables de cobre aislados estándar a los terminales de salida del conector de cable y los otros extremos a conectores macho de plátano. Encienda la fuente de alimentación pulsando el botón ON-OFF del panel frontal. Active el canal uno pulsando el botón uno.
Después, pulse el botón cuatro para ajustar la tensión. Ajuste la salida de carga a 2,5 voltios. A continuación, pulse Intro.
El día en que las células son tratadas con tallo E, esterilizar los electrodos en 70%solución de etanol durante 30 minutos. Luego, séquelos bajo luz UV en un armario de seguridad durante 30 minutos adicionales. En una campana de flujo laminar, cubra la placa de seis pozos que contiene los MSC cultivados con la tapa equipada con los electrodos, asegurándose de que los electrodos estén completamente sumergidos en el medio.
Luego, transfiera la placa cubierta de seis pozos con las células a la incubadora y conecte sus cables a la fuente de alimentación. A continuación, establezca la fuente de alimentación en una salida de carga de 2,5 voltios y trate las células con el vástago E durante una hora. Después de la estimulación, desconecte la fuente de alimentación y retire la cámara del vástago E de la incubadora.
En condiciones estériles, reemplace la tapa, equipada con electrodos, con una tapa de placa estándar de seis pozos. Posteriormente, devuelva las células a la incubadora y déjelas durante la noche. Limpie los electrodos, primero con PBS y luego con una solución de etanol al 70%.
A continuación, limpie los productos de corrosión acumulados de la superficie del electrodo con papel de lija fino. Repita el tratamiento del tallo E durante seis días consecutivos. El cuarto día, antes de aplicar la estimulación eléctrica, y en condiciones estériles, cambiar el medio de cultivo aspirando 1,5 mililitros de medio y sustituyéndolo por 1,5 mililitros de medio de diferenciación osteogénico fresco precalentó.
Después de aplicar la estimulación eléctrica durante siete días consecutivos, mantener las células en cultivo durante siete días adicionales, intercambiando el medio cada tres a cuatro días. Cuando se complete el tratamiento, analice los cambios de morfología celular bajo un microscopio. Para evaluar el efecto de la estimulación eléctrica en la diferenciación osteogénica de MSC, mida la deposición de calcio, la actividad de fosfatasa alcalina y la expresión génica del marcador osteogénico, como se describe en otros lugares.
Para evaluar el efecto de 100 milivoltios por milímetro de estimulación eléctrica en la diferenciación osteogénica de MSC, las células tratadas con estimulación eléctrica durante tres, siete y 14 días y las células no tratadas, se analizaron en el día 14 del cultivo mediante la evaluación de los cambios morfológicos y la deposición de calcio. Los cambios significativos en la morfología celular y los depósitos de calcio fueron visibles en las células tratadas con estimulación eléctrica durante siete y 14 días. Se realizó un análisis detallado de los cambios osteogénicos de la expresión génica del marcador en los días tres, siete y 14 del cultivo.
En el séptimo día de cultivo, la expresión De RunX2 fue significativamente mayor en células tratadas con estimulación eléctrica durante siete días. Mientras que la expresión de Colla1 fue significativamente mayor en las células tratadas durante siete días, medidas en el día 14 del cultivo. La expresión de osteopontina se incrementó significativamente en las células estimuladas eléctricamente en los días tres, siete y 14 del cultivo.
La expresión de Osterix estaba ausente en las células de control en todos los puntos de tiempo, y sólo se vio a los siete y 14 días de cultivo en células expuestas a la estimulación eléctrica. La cámara de estimulación eléctrica es relativamente fácil de construir. Sin embargo, se debe tener especial cuidado al manipular los cables de platino, y también al limpiar y esterilizar los electrodos.
Las células pretratadas a la electricidad en nuestra cámara, solas o sentadas en un material de andamio, podrían implantarse en modelos animales, para estudiar cómo el efecto positivo de la estimulación eléctrica persiste in vitro. Esta técnica proporciona una herramienta simple pero potente para estudiar el mecanismo por el cual la estimulación eléctrica regula las funciones celulares. Este conocimiento puede estar disponible en células de medicina regenerativa.
