ここでは、一般的な六壁培養プレートを用いて電気刺激室を構築する方法と、間葉系幹細胞における骨形成分化を刺激するためにどのように使用するかを示す。このチャンバーは、簡単で、構築するために高価ではない、と複数の実験で再利用することができます。私たちの部屋で電気刺激で前処理された後、間葉系幹細胞は骨組織工学の処置の結果を改善するために使用することができる。
このチャンバーは、他の細胞タイプや、移動、増殖、膜電位の変化、アポトーシス、および慎重な付着のような電気感受性細胞の挙動を調査するためにも使用できます。6つのウェルプレート蓋でマークし、6つの井戸の外側の端の近くに25ミリメートル離れた直径の2つの直径の穴を掘削します。次に、プラチナワイヤーを12 5センチメートルの長いセクションに切ります。
手動でL"形状に各5センチメートルのセクションを曲げ、一方の端は3センチメートル、残りの2センチメートルの長さを残します。その後、銀でコーティングされたワイヤーを2本の35センチメートルの長さに切ります。白金線の長い曲がった端を穴に入れ、蓋の外側から1~2ミリメートル突き出したままにします。
鉗子を使用してそれを曲げる。その後、白金線を蓋穴に超伝導接着剤で固定し、約6時間乾燥させます。陰極を準備するために、蓋から銀でコーティングされたワイヤーの1つに突き出た6本のプラチナワイヤーの先端をすべてはんだ付けします。
アノードを準備するには、残りの6本の白金線を他の銀で覆われたワイヤーにはんだ付けします。続いて、6つのアノード-カソード白金-電極ペアの間の回路にLEDを追加して、機能性を確認します。各 LED の下に黒い絶縁テープを置き、培養プレート内の細胞を LED ライトにさらさないようにします。
次に、ワイヤー端子ブロックコネクタを6ウェルプレートの蓋の左上隅に接着し、両方の銀色で塗られたワイヤを入力端子に接続します。次に、2番目の6ウェルプレート蓋の左上隅から20ミリメートル20ミリメートルの正方形の断面を切り出し、第1の蓋に端子台コネクタを収容する。最初の蓋をカバーし、電極を装備し、2番目の蓋を取り付け、粘着テープでテープを貼ります。
2 本の標準絶縁銅線の一方の端をワイヤ コネクタの出力端子に接続し、もう一方の端をバナナ オス コネクタに接続します。前面パネルのON-OFFボタンを押して電源をオンにします。ボタン1を押してチャンネル1をアクティブにします。
その後、ボタン4を押して電圧を設定します。負荷出力を2.5ボルトに設定します。次に、Enter キーを押します。
細胞をEステムで処理した日に、電極を70%エタノール溶液で30分間殺菌する。その後、安全キャビネット内のUV光の下で30分間乾燥させます。層流フードで、培養したMSCを含む6ウェルプレートに電極を装備した蓋を覆い、電極が媒体に完全に沈み込まないようにします。
次に、覆われた6ウェルプレートを細胞と共にインキュベーターに移し、そのワイヤーを電源に接続します。次に、電源を2.5ボルトの負荷出力に設定し、セルをEステムで1時間処理します。刺激後、電源を外し、インキュベーターからEステムチャンバーを取り外します。
滅菌条件下では、電極を装備した蓋を標準の6ウェルプレート蓋に交換します。続いて、細胞をインキュベーターに戻し、それらを一晩放置する。まずPBSで電極を洗浄し、次に70%エタノール溶液で洗浄します。
次に、蓄積した腐食物を微細なサンドペーパーで電極表面から洗浄します。Eステム治療を6日間連続して繰り返します。4日目には、電気刺激を加える前に、滅菌条件下で、1.5ミリリットルの培地を吸引し、1.5ミリリットルの前温め、新鮮な骨形成分化培地に置き換えることによって培地を変更する。
7日間連続して電気刺激を加えた後、さらに7日間培養中の細胞を維持し、3~4日ごとに培地交換を行う。治療が完了したら、細胞形態変化を顕微鏡で分析します。MSC骨形成分化に対する電気刺激の効果を評価するために、カルシウム沈着、アルカリホスファターゼ活性、および骨形成マーカー遺伝子発現を他の場所で説明するように測定する。
MSC骨形成分化に対する1ミリメートル当たり100ミリボルトの電気刺激の効果を評価するために、3、7、および14日間の電気刺激で処理された細胞と非処理細胞を、形態変化およびカルシウム沈着を評価することによって培養14日目に分析した。細胞形態およびカルシウム沈着物の有意な変化は、7日間および14日間の電気刺激で処理された細胞で見られた。骨形成マーカー遺伝子発現変化の詳細な分析は、培養3日目、7日目、および14日目に行った。
培養7日目、7日間電気刺激で処理した細胞においてRunX2発現が有意に高かった。一方、Colla1発現は7日間処理された細胞において有意に高かったのに対し、培養14日目で測定した。オステオポンチンの発現は、3日目、7日目、および14日目の培養において電気刺激細胞において有意に増加した。
Osterix発現は、コントロール細胞に全ての時点で存在せず、電気刺激にさらされた細胞における培養の7日および14日でのみ見られた。電気刺激室は比較的容易に造る。ただし、白金線の取り扱い時や、電極の洗浄や滅菌の際には、特別な注意が必要です。
私たちの部屋の電気に前処理された細胞は、単独で、または足場材料に座って、電気刺激の肯定的な効果が体外でどのように持続するかを研究するために、動物モデルに埋め込むことができます。この技術は、電気刺激が細胞機能を調節するメカニズムを研究するためのシンプルでありながら強力なツールを提供します。この知識は再生医療細胞で利用可能です。
