Hier zeigen wir, wie man eine elektrische Stimulationskammer mit gängigen sechs Wandkulturplatten baut und wie man sie einsetzt, um die osteogene Differenzierung in mesenchymalen Stammzellen zu stimulieren. Diese Kammer ist einfach und nicht teuer zu bauen, und kann in mehreren Experimenten wiederverwendet werden. Nach der Vorbehandlung mit elektrischer Stimulation in unserer Kammer können mesenchymale Stammzellen verwendet werden, um die Ergebnisse in knochengewebetechnischen Behandlungen zu verbessern.
Diese Kammer kann auch verwendet werden, um andere Zelltypen und elektroempfindliche Zellverhalten wie Migration, Proliferation, Veränderungen im Membranpotential, Apoptose und sorgfältige Anhaftung zu untersuchen. In einem sechs Bohrblechdeckel, markieren und bohren Sie dann zwei Löcher mit einem Millimeter Durchmesser, 25 Millimeter voneinander entfernt, in der Nähe der äußeren Kante jeder der sechs Bohrungen. Als nächstes schneiden Sie einen Platindraht in 12 fünf Zentimeter lange Abschnitte.
Biegen Sie jeden Fünf-Zentimeter-Abschnitt manuell in eine L"-Form, so dass ein Ende drei Zentimeter lang und die anderen zwei Zentimeter lang sind. Dann schneiden Sie den silberbeschichteten Draht in zwei 35-Zentimeter-Längen. Setzen Sie das längere gebogene Ende eines Platindrahtes in das Bohrloch ein, sodass ein bis zwei Millimeter von der Außenseite des Deckels herausragen.
Biegen Sie es mit Zangen. Anschließend die Platindrähte in den Deckellöchern mit superleitendem Kleber befestigen und ca. sechs Stunden trocknen lassen. Zur Vorbereitung der Kathoden löten Sie die Spitzen aller sechs Platindrähte, die vom Deckel auf einen der silberbeschichteten Drähte ragen.
Zur Vorbereitung der Anoden die restlichen sechs Platindrähte auf andere silberbeschichtete Drähte löten. Fügen Sie anschließend LEDs in den Kreislauf zwischen jedem der sechs Anoden-Kathoden-Platin-Elektroden-Paare hinzu, um die Funktionalität zu bestätigen. Legen Sie ein Stück schwarzes Isolierband unter jede LED, um zu verhindern, dass die Zellen in den Kulturplatten LED-Licht aussetzen.
Als nächstes kleben Sie den Drahtklemmenstecker an die linke obere Ecke des Sechs-Well-Plattendeckels und verbinden Sie beide silberbeschichteten Drähte mit den Eingangsklemmen. Schneiden Sie dann einen 20-Millimeter-mal 20-Millimeter-Quadratteil aus der linken oberen Ecke eines zweiten Sechs-Well-Plattendeckels aus, um den Klemmenblockanschluss auf dem ersten Deckel unterzubringen. Bedecken Sie den ersten Deckel, der mit den Elektroden ausgestattet ist, mit dem zweiten Deckel und kleben Sie sie mit Klebeband zusammen.
Schließen Sie ein Ende der beiden standardmäßig isolierten Kupferdrähte an die Ausgangsklemmen des Drahtsteckers und das andere Ende an Bananensteckeranschlüsse an. Schalten Sie das Netzteil ein, indem Sie die ON-OFF-Taste auf der Frontplatte drücken. Aktivieren Sie Kanal eins durch Drücken der Taste eins.
Danach drücken Sie Taste vier, um die Spannung einzustellen. Stellen Sie den Lastausgang auf 2,5 Volt ein. Drücken Sie dann die Eingabetaste.
Am Tag, an dem die Zellen mit E-Stiel behandelt werden, sterilisieren Sie die Elektroden in 70%Ethanol-Lösung für 30 Minuten. Dann trocknen Sie sie unter UV-Licht in einem Sicherheitsschrank für weitere 30 Minuten. In einer laminaren Durchflusshaube bedecken Sie die Sechs-Well-Platte mit den kultivierten MSCs mit dem deckel, der mit den Elektroden ausgestattet ist, und stellen Sie sicher, dass die Elektroden vollständig in das Medium eingetaucht sind.
Übertragen Sie dann die abgedeckte Sechs-Well-Platte mit Zellen an den Inkubator und schließen Sie ihre Drähte an das Netzteil an. Als nächstes stellen Sie die Stromversorgung auf 2,5 Volt Lastausgang und behandeln Sie die Zellen mit E-Stamm für eine Stunde. Trennen Sie nach der Stimulation die Stromversorgung und entfernen Sie die E-Stielkammer aus dem Inkubator.
Ersetzen Sie unter sterilen Bedingungen den mit Elektroden ausgestatteten Deckel durch einen Standard-Sechs-Well-Plattendeckel. Anschließend die Zellen an den Inkubator zurückgeben und über Nacht verlassen. Reinigen Sie die Elektroden zuerst mit PBS und dann mit 70% Ethanollösung.
Reinigen Sie dann die angesammelten Korrosionsprodukte von der Elektrodenoberfläche mit feinem Schleifpapier. Wiederholen Sie die E-Stiel-Behandlung für sechs aufeinanderfolgende Tage. Am vierten Tag, vor der Anwendung der elektrischen Stimulation, und unter sterilen Bedingungen, ändern Sie das Kulturmedium, indem Sie 1,5 Milliliter Medium ansaugen und durch 1,5 Milliliter vorgewärmtes, frisches osteogenes Differenzierungsmedium ersetzen.
Nach der Anwendung der elektrischen Stimulation für sieben aufeinanderfolgende Tage, halten Sie die Zellen in kultur für weitere sieben Tage, Austausch des Mediums alle drei bis vier Tage. Wenn die Behandlung abgeschlossen ist, analysieren Sie die Zellmorphologie-Änderungen unter dem Mikroskop. Um die Auswirkungen der elektrischen Stimulation auf die osteogene MSC-Differenzierung zu bewerten, messen Sie die Kalziumabscheidung, die alkalische Phosphataseaktivität und die osteogene Marker-Genexpression, wie an anderer Stelle beschrieben.
Um die Wirkung von 100 Millivolt pro Millimeter elektrischer Stimulation auf die osteogene MSC-Differenzierung zu bewerten, wurden Zellen, die drei, sieben und 14 Tage lang mit elektrischer Stimulation behandelt wurden, und nicht behandelte Zellen am 14. Tag der Kultur analysiert, indem morphologische Veränderungen und Kalziumablagerungen bewertet wurden. Signifikante Veränderungen in der Zellmorphologie und Kalziumablagerungen waren in Zellen sichtbar, die sieben und 14 Tage lang mit elektrischer Stimulation behandelt wurden. Eine detaillierte Analyse der Veränderungen der osteogenen Marker-Genexpression wurde an den Tagen drei, sieben und 14 der Kultur durchgeführt.
An Tag sieben der Kultur war die RunX2-Expression in Zellen, die sieben Tage lang mit elektrischer Stimulation behandelt wurden, signifikant höher. Während colla1-Expression in Zellen, die sieben Tage lang behandelt wurden, signifikant höher war, gemessen am Tag 14 der Kultur. Die Expression von Osteopontin wurde in elektrisch stimulierten Zellen an den Tagen drei, sieben und 14 der Kultur signifikant erhöht.
Osterix-Expression fehlte in Kontrollzellen zu allen Zeitpunkten und wurde nur bei sieben und 14 Tagen Kultur in Zellen gesehen, die elektrischer Stimulation ausgesetzt waren. Die elektrische Stimulationskammer ist relativ einfach zu bauen. Besondere Vorsicht ist jedoch bei der Handhabung der Platindrähte sowie bei der Reinigung und Sterilisation der Elektroden geboten.
Zellen, die in unserer Kammer mit Strom vorbehandelt wurden, allein oder auf einem Gerüstmaterial sitzend, könnten in Tiermodelle implantiert werden, um zu untersuchen, wie die positive Wirkung der elektrischen Stimulation in vitro fortbesteht. Diese Technik bietet ein einfaches, aber leistungsstarkes Werkzeug, um den Mechanismus zu untersuchen, mit dem elektrische Stimulation die Zellfunktionen reguliert. Dieses Wissen kann in regenerativen Medizinzellen verfügbar sein.
