Qui, mostriamo come costruire una camera di stimolazione elettrica usando le comuni sei piastre di coltura murale, e come usarla per stimolare la differenziazione osteogenica nelle cellule staminali mesenchimali. Questa camera è facile e non costosa da costruire e può essere riutilizzata in più esperimenti. Dopo essere state pretrattate con stimolazione elettrica nella nostra camera, le cellule staminali mesenchimali possono essere utilizzate per migliorare i risultati nei trattamenti di ingegneria del tessuto osseo.
Questa camera può anche essere utilizzata per indagare altri tipi di cellule e comportamenti cellulari elettro-sensibili come migrazione, proliferazione, cambiamenti nel potenziale della membrana, apoptosi e attaccamento attento. In un coperchio a sei piastre, segnare e quindi praticare due fori di diametro di un millimetro, distanti 25 millimetri l'uno dall'altro, vicino al bordo esterno di ciascuno dei sei pozzi. Quindi, tagliare un filo di platino in sezioni lunghe 12 cinque centimetri.
Piegare manualmente ogni sezione di cinque centimetri in una forma A, lasciando un'estremità lunga tre centimetri e gli altri due centimetri di lunghezza. Quindi, tagliare il filo rivestito d'argento in due lunghezze di 35 centimetri. Inserire l'estremità piegata più lunga di un filo di platino nel foro forato, lasciando uno o due millimetri sporgenti dall'esterno del coperchio.
Piegarlo usando le forcep. Successivamente, fissare i fili di platino nei fori del coperchio con colla super conduttiva e lasciarli asciugare per circa sei ore. Per preparare i catodi, saldare le punte di tutti e sei i fili di platino sporgenti dal coperchio a uno dei fili rivestiti in argento.
Per preparare gli anodi, saldare i restanti sei fili di platino ad altri fili rivestiti in argento. Successivamente, aggiungere LED nel circuito tra ciascuna delle sei coppie di elettrodi di platino anodico-catodo per confermare la funzionalità. Posizionare un pezzo di nastro isolante nero sotto ogni LED per evitare di esporre le celle nelle piastre di coltura alla luce a LED.
Quindi, incollare il connettore del blocco terminale del filo nell'angolo in alto a sinistra del coperchio della piastra a sei pozzi e collegare entrambi i fili rivestiti in argento ai terminali di ingresso. Quindi, tagliare una sezione quadrata di 20 millimetri per 20 millimetri dall'angolo in alto a sinistra di un secondo coperchio a piastre a sei porsi, per ospitare il connettore del blocco terminale sul primo coperchio. Coprire il primo coperchio, dotato degli elettrodi, con il secondo coperchio, e rastrerli insieme al nastro adesivo.
Collegare un'estremità dei due fili di rame isolati standard ai terminali di uscita del connettore del filo e l'altra estremità ai connettori maschi di banana. Accendere l'alimentatore premendo il tasto ON-OFF sul pannello frontale. Attivare il canale uno premendo il pulsante uno.
Successivamente, premere il pulsante quattro per impostare la tensione. Impostare l'uscita di carico a 2,5 volt. Quindi premere INVIO.
Il giorno in cui le cellule vengono trattate con fusto E, sterilizzare gli elettrodi in soluzione di etanolo al 70% per 30 minuti. Quindi, asciugarli sotto la luce UV in un armadio di sicurezza per altri 30 minuti. In una cappa di flusso laminare, coprire la piastra a sei po', contenente i CCC coltivati con il coperchio dotato degli elettrodi, assicurandosi che gli elettrodi siano completamente immersi nel mezzo.
Quindi, trasferire la piastra coperta a sei pozzi con le celle all'incubatore e collegare i suoi fili all'alimentatore. Successivamente, impostare l'alimentatore su 2,5 volt di uscita di carico e trattare le cellule con gambo E per un'ora. Dopo la stimolazione, scollegare l'alimentatore e rimuovere la camera dello stelo E dall'incubatore.
In condizioni sterili, sostituire il coperchio, dotato di elettrodi, con un coperchio standard a piastre a sei possi bene. Successivamente, riportare le cellule nell'incubatrice e lasciarle durante la notte. Pulire gli elettrodi, prima con PBS e poi con soluzione di etanolo al 70%.
Quindi, pulire i prodotti di corrosione accumulati dalla superficie dell'elettrodo con carta vetrata fine. Ripetere il trattamento dello stelo E per sei giorni consecutivi. Il quarto giorno, prima di applicare la stimolazione elettrica, e in condizioni sterili, cambiare il mezzo di coltura aspirando 1,5 millilitri di mezzo e sostituendolo con 1,5 millilitri di mezzo di differenziazione osteogenico fresco preri riscaldato.
Dopo aver applicato la stimolazione elettrica per sette giorni consecutivi, mantenere le cellule in coltura per altri sette giorni, scambiando il mezzo ogni tre o quattro giorni. Al termine del trattamento, analizzare i cambiamenti della morfologia cellulare al microscopio. Per valutare l'effetto della stimolazione elettrica sulla differenziazione osteogenica MSC, misurare la deposizione di calcio, l'attività della fosfatasi alcalina e l'espressione genica marcatore osteogenica, come descritto altrove.
Per valutare l'effetto di 100 millivolt per millimetro di stimolazione elettrica sulla differenziazione osteogenica MSC, le cellule trattate con stimolazione elettrica per tre, sette e 14 giorni e le cellule non trattate, sono state analizzate al giorno 14 della coltura valutando i cambiamenti morfologici e la deposizione di calcio. Cambiamenti significativi nella morfologia cellulare e nei depositi di calcio sono stati visibili nelle cellule trattate con stimolazione elettrica per sette e 14 giorni. Un'analisi dettagliata dei cambiamenti dell'espressione genica marcatore osteogenica è stata eseguita nei giorni tre, sette e 14 della coltura.
Al settimo giorno di coltura, l'espressione runx2 era significativamente più alta nelle cellule trattate con stimolazione elettrica per sette giorni. Mentre l'espressione di Colla1 era significativamente più alta nelle cellule trattate per sette giorni, misurate al giorno 14 della coltura. L'espressione dell'osteopontina è stata significativamente aumentata nelle cellule stimolate elettricamente nei giorni tre, sette e 14 della coltura.
L'espressione di Osterix era assente nelle cellule di controllo in tutti i punti di tempo, ed era vista solo a sette e 14 giorni di coltura nelle cellule esposte alla stimolazione elettrica. La camera di stimolazione elettrica è relativamente facile da costruire. Tuttavia, è necessario prestare particolare attenzione quando si maneggiano i fili di platino e anche quando si puliscono e sterilizzano gli elettrodi.
Le cellule pretrattate all'elettricità nella nostra camera, sole o seduti su un materiale impalcatura, potrebbero essere impiantate in modelli animali, per studiare come l'effetto positivo della stimolazione elettrica persista in vitro. Questa tecnica fornisce uno strumento semplice ma potente per studiare il meccanismo con cui la stimolazione elettrica regola le funzioni cellulari. Questa conoscenza può essere disponibile nelle cellule di medicina rigenerativa.
