Este es un método para aplicar estimulación electromecánica en las células. Tiene múltiples aplicaciones para estudiar sus efectos en una población celular, pre-entrenamiento para el parto in vivo, y la maduración celular. La ventaja es que los estímulos eléctricos y mecánicos se pueden aplicar con el mismo dispositivo de forma individual o simultánea, manteniendo intacto el viral estéril.
Esta técnica es un enfoque indirecto de nuestra terapia. La terapia celular se considera células electromecánicamente estimuladas puede ser una población celular interesante para tratar el intro-miocardio. Este método generalmente pertenece al campo cardiovascular, pero también podría aplicarse al sistema nervioso.
Esta es una técnica fácil que requiere paciencia. La parte más difícil será trabajar con las piezas pequeñas, y mantener la esterilidad en todo. Hay pequeños detalles de manipulación que son difíciles de explicar, por lo que la demostración visual es realmente útil.
Comience transfiriendo 12 construccionesmpitempirosmpis limpias a placas estériles de 10 centímetros. Para asegurar la esterilización completa, exponga las placas a la luz UV durante cinco minutos. Luego transfiera cada construcción a una placa de cultivo celular separada de 35 milímetros, o placas de 6 pozos para la siembra inmediata de células.
Para iniciar la siembra celular, primero lave un matraz T75 confluente de ATDPS cardíacos con cinco mililitros de 1x PBS. Para separar las células, agregue un mililitro de 0.05%trypsin-EDTA. Y incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos.
A continuación, agregue cinco mililitros de medio completo para inactivar la trippsina-EDTA. Recoger todas las células separadas en un tubo de 15 mililitros. Lave el vaso celular dos veces con cinco mililitros de PBS para recoger las células restantes, y agréguelas al tubo de 15 mililitros.
Centrifugar a 230 g durante cinco minutos a 22 grados centígrados. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en dos mililitros de medio completo, y contarlas con el hemociclo. Siembra 200 microlitros de ATDPC cardíacos en cada placa con las construcciones PDMS para obtener alrededor del 80% de la superficie de siembra cubierta por las células al día siguiente.
Incubar a 37 grados centígrados y 5%CO2. Agregue suavemente 2 mililitros de medio completo precalentó por placa. Incubar las células con las construcciones a 37 grados centígrados, y 5%CO2 durante la noche.
Antes de iniciar este procedimiento, asigne seis de las 12 construcciones para la estimulación electromecánica y conserve seis para controles no estimulados. Utilice 70%etanol para limpiar la unidad de estimulación. Coloque la unidad de estimulación, los electrodos estériles y las pinzas dentro del gabinete de flujo.
Con el fin de manipular fácilmente los electrodos y construcciones, retire el 90% del medio de cada placa de cultivo celular. Coloque las construcciones PDMS en la posición correcta hacia el imán para asegurar la atracción magnética entre imanes fijos y móviles. Estos dos pasos anteriores en los que se manipulan las construcciones PDMS semillas de la célula y los electrodos, manteniendo la esterilidad durante todo el proceso son los más críticos.
A continuación, conecte el cable de platino a los conectores de electrodos. Oriente la parte ptFE de los electrodos en sus espacios designados en las construcciones PDMS. Añadir 2,5 mililitros de medio completo fresco y precalentó a cada construcción.
Una vez que todas las construcciones de PDMS estén colocadas y conectadas eléctricamente a la plataforma, vuelva a colocar la plataforma en los 37 grados Centígrados y en la incubadora de 5%CO2. A continuación, conecte la fuente eléctrica y mecánica. Para configurar el programa de estimulación, especifique los regímenes de estimulación eléctrica y mecánica a través de las interfaces de usuario del estimulador eléctrico y la aplicación, que controla la estimulación mecánica.
Para ajustar el sincronismo, encienda el estimulador eléctrico y espere a que aparezca el menú principal en la pantalla. A continuación, seleccione la opción dos, edite la secuencia, más Intro. Para editar el menú de secuencia, utilice la pestaña de modo para seleccionar current"haciendo clic en plus" y pulsando Intro"Para el período, seleccione 1000"con más/menos y pulse Intro"Y para la pestaña del modo de disparo, seleccione externo por software y pulse Intro"Para la pestaña de amplitud, seleccione 1" con más/menos y pulse Intro"Entonces, de nuevo en el menú principal, seleccione la opción 4, y luego genere la secuencia, y presione Entrar"En la sección de estimulación mecánica del panel de aplicación de control, primero escriba 1000"en el control de texto más.
A continuación, escriba 500 "en el control de texto de tiempo ON, para establecer la duración del pulso mecánico. Por último, escriba 2000"en el control de texto de la excursión para ofrecer un 10% de alargamiento de construcción. Cambie el medio celular dos veces por semana, primero quitando los medios antiguos y, a continuación, agregando medios cálidos y frescos en los lados de la compatibilidad con PDMS.
En el día siete, al final del experimento, recoja las muestras como se describe en el manuscrito. Los ATDPC cardíacos estimulados electromecánicamente mejoraron su potencial cardiomiogénico. Esto fue indicado por PCR en tiempo real que muestra una mayor expresión de genes cardíacos tempranos y tardíos específicamente el factor de transcripción cardíaca GATA-4, el marcador estructural beta-miosina cadena pesada, y el gen relacionado con el calcio Connexin43.
La tinción de faloideína contra las fibras de actina mostró que la mayoría de las células se alinearon de acuerdo con el patrón vertical. La distribución de Connexin43 fue principalmente en el citoplasma, y en la membrana plasmática, contribuyendo a la comunicación intracelular a través de uniones de brecha. Los factores de transcripción MEF2 y GATA-4 se localizaron en los núcleos de los ATDPC cardíacos.
Pero GATA-4 no se detectó en los ATDC subcutáneos. Los marcadores citoplasmáticos SERCA2, y la alfa-actinina sarcomérica, no mostraron una organización de sarcomere maduro típico de los cardiomiocitos. Y la paliza no se observó en el control y estimuló las poblaciones celulares.
Una monocapa de células sanas al principio de este protocolo y mantener la esterilidad durante todo el procedimiento son cruciales. Después de la recolección de muestras, se pueden realizar las técnicas estándar de expresión de proteínas del genoma. Esta técnica ayuda a entender mejor el efecto de los estímulos eléctricos y/o mecánicos celulares.
Hasta hace poco, era imposible utilizar el mismo dispositivo para ambas estimulaciones, lo que hacía que los resultados fueran más difíciles de comparar.
