Здесь мы показываем, как построить электрическую камеру стимуляции с использованием общих шестистенных пластин культуры, и как использовать его для того, чтобы стимулировать остеогенную дифференциацию в мезенхимальных стволовых клетках. Эта камера проста и не дорого строить, и может быть повторно использована в нескольких экспериментах. После предварительной обработки с электрической стимуляции в нашей камере, мезенхимальные стволовые клетки могут быть использованы для улучшения результатов в костной ткани инженерных процедур.
Эта камера также может быть использована для исследования других типов клеток и электрочувствительных клеток поведения, как миграция, пролиферация, изменения в мембранном потенциале, апоптоз, и тщательное вложение. В шести скважин пластины крышкой, знак, а затем просверлить два одного миллиметра диаметром отверстия, 25 миллиметров друг от друга, вблизи внешнего края каждой из шести скважин. Затем разрежьте платиновую проволоку на 12 секций длиной пять сантиметров.
Вручную согните каждую пятисемейную секцию в форму L, оставив один конец длиной три сантиметра, а другой два сантиметра в длину. Затем разрежьте проволоку с серебряным покрытием на две длины 35 сантиметров. Вставьте более длинный изогнутый конец платиновой проволоки в просверленное отверстие, оставляя один-два миллиметра, выступающие с внешней стороны крышки.
Согните его с помощью типсов. После этого закрейте платиновые провода в отверстиях крышки сверхпроводящитым клеем и оставьте их высохнуть в течение примерно шести часов. Чтобы подготовить катоды, припой советы всех шести платиновых проводов, выступающие из крышки в один из серебряных покрытием проводов.
Чтобы подготовить аноды, припой оставшиеся шесть платиновых проводов к другим серебряным покрытием проводов. Впоследствии добавьте светодиоды в схему между каждой из шести анодо-катодных платиновых электродных пар, чтобы подтвердить функциональность. Поместите кусок черной изоляционной ленты под каждый светодиод, чтобы предотвратить подвергая клетки в культуре пластины светодиодного света.
Затем приклейте разъем блока проволочного терминала к верхнему левому углу крышки пластины из шести хорошо, и соедините оба провода с серебряным покрытием к входным терминалам. Затем вырежьте 20-миллиметровый на 20-миллиметровый квадратный участок из верхнего левого угла второй крышки пластины из шести хорошо, чтобы разместить разъем блока терминала на первой крышке. Обложка первой крышкой, оснащенной электродами, со второй крышкой, и лента их вместе с клейкой лентой.
Подключите один конец двух стандартных изолированных медных проводов к выходным терминалам разъема провода, а другой заканчивается банановыми мужскими разъемами. Включите питание, нажав кнопку ON-OFF на передней панели. Активируйте первый канал, нажав кнопку один.
После этого нажмите кнопку четыре, чтобы установить напряжение. Установите выход нагрузки на 2,5 вольт. Затем нажмите Enter.
В день клетки обрабатываются стеблем Е, стерилизовать электроды в 70%этаноловом растворе в течение 30 минут. Затем высушите их под ультрафиолетовым светом в шкафу безопасности еще на 30 минут. В ламинарный капюшон потока, покрыть шесть хорошо пластины, содержащей культурные MSCs с крышкой оснащен электродами, убедившись, что электроды полностью погружены в среду.
Затем перенесите покрытую шестиявую пластину с ячейками в инкубатор и соедините ее провода с питанием. Затем установите источник питания до 2,5 вольт нагрузки выход и лечить клетки с E стебель в течение одного часа. После стимуляции отключите электроснабжение и удалите стволовую камеру E из инкубатора.
В стерильных условиях замените крышку, оснащенную электродами, стандартной крышкой из шести хорошо. Впоследствии верните клетки в инкубатор и оставьте их на ночь. Очистите электроды, сначала с помощью PBS, а затем с 70%этанола раствора.
Затем очистите накопленные продукты коррозии от поверхности электрода тонкой наждачной бумагой. Повторите лечение E стволовыми в течение шести дней подряд. На четвертый день, до применения электрической стимуляции, и в стерильных условиях, изменить культуру среды, аспирации 1,5 миллилитров среды и заменить его 1,5 миллилитров предварительно разогретой, свежей остеогенной дифференциации среды.
После применения электрической стимуляции в течение семи дней подряд, поддерживать клетки в культуре в течение еще семи дней, обменивая среды каждые три-четыре дня. Когда лечение завершено, проанализируйте изменения морфологии клеток под микроскопом. Оценить влияние электрической стимуляции на остеогенную дифференциацию MSC, измерить осаждение кальция, активность щелочной фосфатазы и экспрессию генов остеогенного маркера, как описано в других местах.
Для оценки влияния 100 милливольт на миллиметр электрической стимуляции на остеогенную дифференциацию MSC, клетки, обработанные электрической стимуляцией в течение трех, семи и 14 дней и необработаваемые клетки, были проанализированы в день 14 культуры путем оценки морфологических изменений и осаждения кальция. Значительные изменения в морфологии клеток и отложениях кальция были видны в клетках, обработанных электрической стимуляцией в течение семи и 14 дней. Детальный анализ изменений экспрессии генов остеогенного маркера был проведен в дни 3, 7 и 14 культуры.
На седьмой день культуры экспрессия RunX2 была значительно выше в клетках, обработанных электрической стимуляцией в течение семи дней. В то время как выражение Colla1 было значительно выше в клетках, обработанных в течение семи дней, измеренных в день 14 культуры. Выражение остеопонтина было значительно увеличено в электрически стимулированных клетках в дни 3, 7, и 14 культуры.
Выражение osterix отсутствовало в контрольных клетках во все моменты времени, и было замечено только в семь и 14 дней культуры в клетках, подверженных электрической стимуляции. Электрическая камера стимуляции относительно проста в сборке. Однако особое внимание следует принимать при обращении с платиновыми проводами, а также при очистке и стерилизации электродов.
Клетки, предварительно обработанные электричеством в нашей камере, в одиночку или сидящие на эшафоте, могут быть имплантированы в модели животных, чтобы изучить, как положительный эффект электрической стимуляции сохраняется в пробирке. Этот метод обеспечивает простой, но мощный инструмент для изучения механизма, с помощью которого электрическая стимуляция регулирует функции клеток. Эти знания могут быть доступны в клетках регенеративной медицины.
