우리의 프로토콜은 조사관이 면역 형광 얼룩에 의해 유사한 집단의 phenotypic 특성화를 수행하기위한 표준화 된 실험 파이프 라인을 구현하는 데 도움이됩니다. 이 기술을 통해 연구자들은 복잡한 질병 조직의 유사한 구성을 엄격하게 분석하고 관심있는 세포 유형의 표현형에 대한 질적 및 정량적 분석을 수행 할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 기술자 인 시드니 마한 (Sidney Mahan)이 될 것입니다.
브라치오셉할릭 동맥 수확을 위해 동물을 준비하려면 복막을 흉골까지 자르고 복부 조직을 손상시키지 않도록 주의하십시오. 그리고 흉부를 통해 중간 액실라인에서 두 개의 상처를 내어 심장과 폐를 손상시키지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 다이어프램을 잘라 심장을 부분적으로 노출시합니다.
마우스를 교화하기 위해, 유혈액의 압력이 혈관 형태의 일관된 증혈 및 유지를 허용하기 위해 평균 뮤린 혈압과 동일하도록 중력 풍부 시스템을 설치한다. 그런 다음 실온 PBS 5밀리리터, 4%의 실온 파라포름알데히드10밀리리터, 실온 PBS 5개 추가 밀리리터를 가진 동물을 교묘하게 한다. 23 또는 25 게이지 나비 바늘을 중력 주입 시스템에 연결하고 바늘을 통해 PBS를 실행하여 바늘을 튜브에서 배출한 후 바늘을 왼쪽 심실로 삽입합니다.
바늘을 제자리에 고정한 후 홍채 가위를 사용하여 오른쪽 아트리움에서 2센티미터 미만의 절개를 합니다. 관심 있는 조직을 신선한 4% 파라포름알데히드로 수확하십시오. brachiocephalic 동맥을 노출하려면 가위를 사용하여 주루엄을 통해 흉골의 중간선을 절개하고 집게를 사용하여 흉곽의 양쪽을 당겨 가슴 구멍을 완전히 엽니다.
다음으로, 동물을 해부 현미경으로 부분적으로 가리게 하고, 미세핀셋을 사용하여 근육, 결합 조직 및 지방을 당기고 오른쪽 경동맥, brachiocephalic 동맥, 서브클라비아 양분 및 대동맥 아치가 주변 결합 조직 및 지방을 청소하고 격리할 때까지 사용합니다. 다음으로, 집게를 사용하여 양분 아래 의 오른쪽 경동맥을 잡고 집게 위에 초기 절단을합니다. 그럼에도 불구하고 경동맥을 들고 서브클라비아 동맥을 두 번째 로 자르고 브라치오페할릭 동맥 양쪽의 대동맥 아치를 통해 마지막 두 컷을 만듭니다.
그런 다음, 관심있는 다른 혈관 조직을 수집하고 실온에서 하룻밤 동안 4 %의 para포름 알데히드 용액에 brachiocephalic 동맥 및 기타 조직을 배치합니다. brachiocephalic 동맥의 면역 형광 염색을 위해, 대동맥 아치가 단면되고 brachiocephalic 동맥이 보이는 빛 현미경 검사법에 의해 확인될 때까지 파라핀 임베디드 조직 견본을 통해 10 마이크로미터 단면을 얻기 위하여 마이크로토메를 이용하십시오. 조직이 마이크로톤 블레이드에 완전히 수직이 될 때까지 블록의 방향을 조정하고 유리 슬라이드 당 brachiocephalic 동맥의 3 개의 연속 10 마이크로 미터 두께 의 섹션을 얻을 때까지, 서브 클라비아양에 도달 할 때까지.
모든 섹션이 수집되면 화학 후드 아래에서 2개의 5분 자일렌 몰입으로 조직 샘플을 수화하고, 5분 침수 에탄올 시리즈와 2개의 5분 디온화 수질 침수이 발생합니다. 다음으로, 표준 프로토콜에 따라 항원 검색 용액의 슬라이드를 인큐베이션한 다음 전자레인지에서 20분 동안 가열합니다. 실온에서 1시간 동안 식힌 후 소수성 펜을 사용하여 각 조직 섹션을 둘러싸십시오.
그리고 실온에서 1 시간 동안 차단 버퍼로 비특이적 바인딩을 차단합니다. 인큐베이션의 끝에서, 관심의 1 차적인 항체 칵테일, 또는 isotype 일치 된 IgG 대조 항체와 4 섭씨에서 하룻밤 조직 샘플을 레이블. 다음 날 아침, PBS에서 세척시간 당 5분 동안 세 번 슬라이드를 세척한 다음, 적절한 형광에 1시간 배양을 유도하여 핵 시각화를 위한 이차 항체 칵테일과 DAPI를 결합합니다.
그런 다음 형광 현미경 검사법에 적합한 마운팅 배지를 사용하여 슬라이드에 커버립을 장착하십시오. 표지된 조직 섹션의 공초점 현미경 이미징의 경우, IgG 제어 및 1차 항체로 얼룩진 섹션을 사용하여 검출기의 감도, 레이저 전력 및 각 개별 채널에 대한 오프셋을 설정합니다. 그런 다음 z 스택 수집을 위해 상하 위치를 설정하고 이미지할 스택의 두께와 수를 결정합니다.
모든 이미지를 획득하면 ImageJ에서 이미지를 열고 채널 도구 패널을 열고 다른 스테닝 채널을 식별할 수 있습니다. 색상 채널을 병합합니다. 모든 채널은 동일한 이미지에서 표시되어야 합니다.
채널 도구 패널 내에서 개별 컬러 채널을 켜고 끄고 계산 아이콘을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 멀티 포인트 도구를 선택합니다. 계산 아이콘을 두 번 클릭하여 점 도구 패널을 열고 셀을 계산하는 데 사용되는 항목의 유형과 크기를 선택합니다. 모든 것을 표시하고 채널 도구 패널에서만 DAPI 채널을 켭니다.
그런 다음, 카운터 채널 0을 선택하고 태그할 개별 핵을 클릭하여 z 스택을 스크롤하여 관심 영역 내에 스테인드된 모든 핵을 계산합니다. 정량화된 단일 셀 이벤트의 수는 포인트 도구 패널에 아래에 표시됩니다. 모든 핵이 태그되었을 때, 다른 염색 채널을 켜고 DAPI와 항체 염색 사이에 공동화가 있는 세포를 태그하기 위해 카운터 채널 하나를 선택한다.
세포질 염색의 경우 핵의 전체 깊이에 걸쳐 핵을 둘러싼 염색을 가진 세포를 선택하고 필요에 따라 여러 z 스택을 확인하십시오. 결과는 그 때 DAPI 양성 세포의 총 수에 세포의 수로, 또는 관심 영역 내의 영역당 세포의 수로 표현될 수 있다. 표현성 마커를 표적으로 하는 항체를 통한 면역형 염색은, 입증된 바와 같이, 단일 세포 계수에 대한 관심 영역의 묘사를 위해 획득될 수 있는 각 개별 마커 염색 및 차등 간섭 대조의 심상을 허용합니다.
단일 세포 계수는 다른 평활근 세포 유래 집단의 풍부를 결정하기 위해 ImageJ를 사용하여 수행 될 수있다. 예를 들어, 이들 대표적인 단면의 섬유질 캡 영역에서의 단일 세포 계수 분석은 항 IL-1 베타 항체로 처리된 마우스 와 마우스 사이의 섬유캡 영역의 세포 구성에 현저한 차이를 나타내며 IG 대조군으로 처리되었다. 실제로, IL-1 베타의 억제는 YFP 양성 평활근 세포의 감소와 연관되었다, 및 galectin-3 양성 세포의 증가.
또한, YFP 양성 평활근 대동맥 알파 액틴 양성 평활근 세포의 수가 감소하는 것을 관찰하였다. 평활근 세포 유래 YFP 양성 갈렉틴-3 양성 대식세포의 상대적 수는 두 brachiocephalic 동맥 위치에서 크게 증가했습니다. 특히, IL-1 베타의 억제는 병변 내의 골조온드로겐 세포의 전체 수에 영향을 미치지 못하거나, 또는 연무근육 세포 유래 또는 대식세포 유래 연골 세포의 비율에 영향을 미치지 않았다.
이 프로토콜은 조직 수집, 처리 및 단면화뿐만 아니라 단일 세포 계수와 같은 주요 단계를 표준화하여 죽상 경화성 병변 분석에서 엄격성과 재현성을 향상시키도록 설계되었습니다. 이 프로토콜은 대동맥 및 대동맥 뿌리를 포함하는 죽상 경화성 병변을 제시하는 경향이 추가 혈관 침대를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
