הפרוטוקול שלנו מסייע לחוקרים ליישם צינורות ניסיוניים מתוקקנים לביצוע אפיון פנוטיפי של אוכלוסיות דומות על ידי כתמים immunofluorescent. בעזרת טכניקה זו, חוקרים יכולים לנתח בקפדנות את ההרכב הדומה של רקמות מחלה מורכבות ולבצע ניתוחים איכותיים וכמותיים של הפנוטיפים של סוגי התאים המעניינים. הדגמת ההליך תהיה סידני מהאן, טכנאי מהמעבדה שלי.
כדי להכין את החיה לקציר עורקים brachiocephalic, לחתוך את הצמיטונום עד עצם החזה, דואג לא לפגוע ברקמות הבטן. ולעשות שני חתכים בקו האמצע בית החזה דרך בית החזה, דואג לא לפגוע בלב ובריאות. לאחר מכן, לחתוך את הסרעפת לחשוף חלקית את הלב.
כדי לפאר את העכבר, להתקין מערכת שפע כבידה, כך הלחץ של נוזל שפע שווה ללחץ הדם הממוצע מורין כדי לאפשר שפע עקבי ותחזוקה של המורפולוגיה כלי. לאחר מכן, בשפע את החיה עם חמישה מיליליטר של טמפרטורת החדר PBS, 10 מיליליטר של 4% טמפרטורת החדר paraformaldehyde, וחמישה מיליליטר נוספים של טמפרטורת החדר PBS. חבר מחט פרפר 23 או 25 מד למערכת שפע הכבידה, ולהפעיל PBS דרך המחט כדי לגרש את האוויר מן הצינורות לפני החדרת המחט לתוך החדר השמאלי.
לאחר אבטחת המחט במקום, להשתמש מספריים איריס לעשות חתך פחות משני סנטימטר באטריום הנכון. לקצור את הרקמות של עניין לתוך טרי 4% paraformaldehyde. כדי לחשוף את העורק brachiocephalic, להשתמש במספריים כדי להפוך חתך לאורך קו האמצע של עצם החזה דרך manubrium ולהשתמש מדפים למשוך את שני הצדדים של בית החזה כדי לפתוח את חלל החזה באופן מלא.
לאחר מכן, מניחים את החיה תחת מיקרוסקופ ניתוח כדי לדמיין חלקית את התרדמה, ולהשתמש פינצטה עדין כדי למשוך את השרירים, רקמת חיבור, ושומן עד העורק הראשי הנכון, עורק brachiocephalic, bifurcation subclavian, וקשת העורק מנוקים ומבודדים של רקמת החיבור שמסביב ושומן. לאחר מכן, השתמש במטחנים כדי לתפוס את הראש הימני מתחת bifurcation שלה ולעשות חתך ראשוני מעל המדפים. ובכל זאת, מחזיק את העורק הראשי, לעשות חתך שני דרך העורק התת-קלבי ולעשות את שני החתכים האחרונים דרך קשת העורק משני צדי העורק brachiocephalic.
לאחר מכן, לאסוף כל רקמות כלי דם אחרים של עניין ולמקום את העורק brachiocephalic ואת הרקמות האחרות בתספור paraformaldehyde 4% לילה בטמפרטורת החדר. עבור כתמים immunofluorescent של העורק brachiocephalic, להשתמש microtome כדי להשיג 10 מקטעי מיקרומטר דרך מדגם רקמה מוטבע פרפין עד שניתן לאשר על ידי מיקרוסקופ אור כי קשת העורק כבר חתך דרך העורק brachiocephalic גלוי. התאימו את כיוון הבלוק עד שהרקמה תנוון לחלוטין ללהב המיקרוטום ותשיג שלושה חלקים טוריים בעובי 10 מיקרומטר של העורק הברכיוצפלי לכל מגלשת זכוכית, עד להגשת הביפורציה התת-קלאבית.
כאשר כל החלקים נאספו, לחות את דגימות הרקמה מתחת למכסה המנוע כימי עם שתי טבילות קסילן חמש דקות, ואחריו סדרת אתנול טבילה חמש דקות כפי שצוין, ושתי דקות של טבילת מים deionized חמש דקות. לאחר מכן, דגירה מחליקה בתת פתרון אחזור אנטיגן, על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, ואחריו חימום במיקרוגל במשך 20 דקות. לאחר שעה של התקררות בטמפרטורת החדר, השתמש בעט הידרופובי כדי להקיף כל קטע רקמה.
ולחסום כל כריכה לא ספציפית עם חוצץ חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, סמן את דגימות הרקמה בן לילה בארבע מעלות צלזיוס עם קוקטייל הנוגדנים העיקרי של עניין, או isotype תואם נוגדני בקרת IgG. למחרת בבוקר, לשטוף שקופיות שלוש פעמים PBS במשך חמש דקות לכל לשטוף, ואחריו דגירה של שעה אחת פלואורסצנטיות המתאימה חרם קוקטייל נוגדנים משני DAPI עבור הדמיה גרעין.
לאחר מכן, השתמשו במדיום הרכבה המתאים למיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להרכיב כיסויים על השקופיות. להדמיית מיקרוסקופיה קונפוקאלית של מקטעי הרקמה המסומן, השתמש במקטעים המוכתמים בבקרת IgG ובנוגדנים ראשוניים כדי להגדיר את הרגישות, כוח הלייזר וההיסט של הגלאי עבור כל ערוץ בנפרד. לאחר מכן, הגדר את המיקומים העליונים והתחתונים עבור רכישת מחסנית z וקבע את העובי ואת מספר הערימות שיש לדמיין.
לאחר שכל התמונות נרכשו, פתחו את התמונות ב-ImageJ פתחו את החלונית 'כלי ערוץ' וצבע מדומה בערוצי הכתמים השונים. מזג את ערוצי הצבע. כל הערוצים צריכים להיות גלויים באותה תמונה.
הפעל וכבה ערוצי צבע בודדים בחלונית 'כלי ערוץ', ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על סמל הספירה כדי לבחור בכלי מרובה הנקודות. לחצו פעמיים על סמל הספירה לפתיחת החלונית 'כלי נקודה' ובחרו בסוג ובגודל הפריטים ששימשו לספירת התאים. בדקו את כל ההצגה והפעילו את ערוץ DAPI רק בחלונית 'כלי ערוץ'.
לאחר מכן, בחר ערוץ מונה אפס ולחץ על גרעינים בודדים להיות מתויגים, גלילה דרך ערימות z כדי לספור את כל הגרעינים מוכתמים בתוך האזור של עניין. מספר האירועים החד-תאיים לכמת יצוין להלן בחלונית כלי הנקודות. כאשר כל הגרעינים תויגו, הפעל ערוץ כתמים אחר ובחר ערוץ מונה אחד כדי לתייג את התאים שבהם יש colocalization בין DAPI ואת כתמי הנוגדן.
עבור כתמים ציטופלסמיים, בחר תאים עם כתמים המקיפים את הגרעין לאורך כל עומק הגרעין, בדיקת ערימות z מרובות לפי הצורך. לאחר מכן ניתן לבטא את התוצאות כמספר התאים למספר הכולל של תאים חיוביים DAPI, או כמספר התאים לכל אזור באזור המעניין. כתמים Immunofluorescent עם נוגדנים מיקוד סמנים פנוטיפיים, כפי שהודגם, מאפשר תמונות של כל סמן בודד מכתים ניגוד הפרעה דיפרנציאלית להיות נרכש עבור תיאור של אזורים מעניינים עבור ספירת תאים בודדים.
לאחר מכן ניתן לבצע ספירת תאים בודדים כדי לקבוע את השפע של אוכלוסיות שונות של תאי שריר חלקים באמצעות ImageJ. לדוגמה, ניתוח ספירת תאים בודדים באזור הכובע הסיבי של חתך מייצג זה חשף הבדלים יוצאי דופן בהרכב התאי של אזור הכובע הסיבי בין עכברים שטופלו בנוגדן בטא נגד IL-1 ועכברים שטופלו בבקרת IgG תואמת איזוטיפ. ואכן, העיכוב של IL-1 בטא היה קשור עם ירידה בתאי שריר חלקים חיוביים YFP, ועל עלייה בתאים גלקטין-3 חיובי.
כמו כן, נצפתה ירידה במספר תאי השריר החלקים החיוביים של השרירים החלקים של YFP. בעוד המספר היחסי של תא שריר חלק נגזר YFP חיובי גלאקטין-3 חיובי מקרופאגים הוגדלה באופן משמעותי בשני מיקומי עורק brachiocephalic. יש לציין כי העיכוב של IL-1 בטא לא השפיע על המספר הכולל של תאים osteochondrogenic בתוך הנגע, או את חלקם של תא שריר חלק נגזר או מקרופאג נגזר תאים כונדרוגניים.
פרוטוקול זה תוכנן כדי לשפר את הקשיחות ואת הרבייה בניתוח נגע טרשת יותרת שרירים על ידי סטנדרטיזציה של צעדים מרכזיים כגון איסוף רקמות, עיבוד וקטעים, כמו גם ספירת תאים בודדים. פרוטוקול זה יכול לשמש לניתוח מיטות כלי דם נוספות הנוטות להציג נגעים טרשת יותרת המוח כולל ביתא ושורש בית הדם.
