我々のプロトコルは、研究者が免疫蛍光染色によって類似集団の表向きの特性評価を行うための標準化された実験パイプラインを実装するのに役立ちます。この技術により、研究者は複雑な疾患組織の類似した組成を厳密に分析し、目的とする細胞タイプの異型の質的および定量的分析を行うことができる。手順を実証することは、私の研究室の技術者であるシドニー・マハンです。
動物を腕頭筋動脈の収穫に備えるために、腹膜を胸骨まで切り、腹部組織に損傷を与えないように注意する。そして、心臓と肺に損傷を与えないように注意して、胸郭を通って中腋窩ラインで2つのカットを行います。次に、ダイヤフラムを切り、心臓を部分的に露出させた。
マウスを多量に使用するには、プロフュージョン流体の圧力が平均マウス血圧に相当し、血管形態の一貫した拡散および維持を可能にするように重力拡散システムを設置する。次いで、5ミリリットルの室温PBS、10ミリリットルの4%の室温パラホルムアルデヒド、および5ミリリットルの室温PBSを用いて動物を使い過ごします。重力拡散システムに23または25ゲージの蝶の針を接続し、左心室に針を挿入する前に、チューブから空気を排出するために針を通してPBSを実行します。
針を所定の位置に固定した後、虹彩はさみを使用して右心房に2センチ未満の切開を行います。目的の組織を新鮮な4%パラホルムアルデヒドに収穫する。腕頭筋動脈を露出するには、はさみを使用して胸骨の正中線を切開し、鉗子を使用して胸部の両側を引っ張って胸腔を完全に開きます。
次に、動物を解剖顕微鏡の下に置いて頸動脈を部分的に視覚化し、右頸動脈、腕頭骨動脈、鎖骨下分岐、および大動脈弓が周囲の結合組織および脂肪を洗浄して分離するまで、細かいピンセットを使用して筋肉、結合組織、脂肪を引っ張ります。次に、鉗子を使用して、その分岐の下の右頸動脈をつかみ、鉗子の上に最初のカットを行います。それでも、頸動脈を保持し、鎖骨下動脈を通して2回目の切り口を作り、最後の2つは虚頭症動脈の両側の大動脈アーチを通って切り取る。
次に、目的の他の血管組織を収集し、ブラキオセファル動脈および他の組織を室温で一晩4%パラホルムアルデヒド溶液に入れる。腕頭動脈の免疫蛍光染色の場合、大動脈が切り離され、腕頭頭動脈が見える光顕微鏡法によって確認されるまで、ミクロトームを使用してパラフィン埋め込み組織サンプルを通して10マイクロメートルの切片を得る。組織がミクロトームブレードに完全に垂直になるまでブロックの向きを調整し、ガラススライドごとに腕頭筋動脈の厚さ3つの連続10マイクロメートルのセクションを得て、鎖骨下分岐に達するまで。
すべての切片が採取されたら、2つの5分間のキシレン浸漬で化学フードの下で組織サンプルを水和し、示された5分間の浸漬エタノールシリーズと2つの5分間の脱イオン水浸漬を行います。次に、抗原検索溶液中のスライドをインキュベートし、標準プロトコルに従い、続いてマイクロ波で20分間加熱する。室温で1時間冷やした後、疎水性ペンを使用して各組織セクションを囲みます。
そして、室温で1時間のブロッキングバッファを有する非特異的な結合をブロックする。インキュベーションの終わりに、目的の一次抗体カクテル、またはアイソタイプがIgG対照抗体と一致して、一晩摂氏4度で組織サンプルを標識する。翌朝、PBSで3回、洗浄につき5分間スライドを洗浄し、続いて適切な蛍光共役二次抗体カクテルと核可視化用DAPIで1時間のインキュベーションを行う。
次に、蛍光顕微鏡に適した取り付け媒体を使用して、スライドにカバースリップを取り付けます。標識された組織切片の共焦点顕微鏡イメージングでは、IgG制御と一次抗体で染色された切片を使用して、検出器の感度、レーザーパワー、および各チャンネルのオフセットを設定します。次に、Z スタック取得の上下の位置を設定し、イメージ化するスタックの厚みと数を決定します。
すべての画像が取得されたら、ImageJで画像を開き、チャンネルツールパネルを開き、異なる染色チャンネルを疑似色にします。カラーチャンネルをマージします。すべてのチャンネルが同じ画像に表示されます。
チャンネル ツール パネル内で個々のカラー チャネルのオンとオフを切り替え、カウント アイコンを右クリックしてマルチポイント ツールを選択します。カウントアイコンをダブルクリックしてポイントツールパネルを開き、セルのカウントに使用するアイテムのタイプとサイズを選択します。[すべて表示] をオンにして、チャンネル ツール パネルでのみ DAPI チャネルをオンにします。
次に、カウンタ チャネル 0 を選択し、タグ付けする個々の核をクリックし、Z スタックをスクロールして、対象領域内で染色されたすべての核をカウントします。ポイント ツール パネルで、定量化された単一セル イベントの数を以下に示します。すべての核がタグ付けされたら、別の染色チャネルをオンにし、カウンターチャネル1を選択して、DAPIと抗体染色の間に共局在化している細胞にタグを付けます。
細胞質染色の場合、必要に応じて複数のZスタックをチェックし、核の深さ全体にわたって核を囲む染色を有する細胞を選択します。その結果は、DAPI の陽性セルの合計数、または対象領域内の領域ごとのセル数に対するセル数として表すことができます。フェノチピッヒマーカーを標的とする抗体による免疫蛍光染色は、示されているように、単一細胞カウントの対象領域の線引きのために個々のマーカー染色および差動干渉コントラストの画像を取得することを可能にする。
異なる平滑筋細胞由来集団の存在量を決定する単一細胞数カウントは、ImageJを使用して実行することができる。例えば、これらの代表的な断面の繊維状キャップ領域における単一細胞計数解析は、IgG対照に一致したアイソタイプで処理したマウスと抗IL-1β抗体で処置したマウスとの間の繊維状キャップ領域の細胞組成の顕著な違いを明らかにした。実際、IL-1 βの阻害は、YFP陽性平滑筋細胞の減少と、ガレクチン-3陽性細胞の増加と関連していた。
また、YFP陽性平滑筋大動脈αアクチン陽性平滑筋細胞の数の減少が認められた。一方、平滑筋細胞由来YFP陽性ガレクチン-3陽性マクロファージの相対的な数は、両方の虚頭症動脈の位置で有意に増加した。特に、IL-1βの阻害は、病変内の骨軟骨細胞の総数、または平滑筋細胞由来またはマクロファージ由来軟骨細胞の割合に影響を及ぼさなかった。
このプロトコルは、組織の採取、処理、切断、および単一細胞数などの主要なステップを標準化することにより、アテローム硬化性病変分析における厳格さと再現性を高めるために設計されています。このプロトコルは、大動脈および大動脈根を含むアテローム硬化性病変を呈しがちな追加の血管床を分析するために使用することができる。
