Este método permite estudiar el mecanismo básico de mielinización y reeyelinación a nivel celular y tisular. Esta técnica está en la encrucijada entre las culturas primarias y los enfoques in vivo. Es un modelo rápido y accesible con la principal ventaja de preservar la arquitectura tisular.
Demostrando el procedimiento estarán Melina Thetiot, investigadora postdoctoral y Remi Ronzano, estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar, inserte unas tijeras pequeñas suavemente en el foramen magnum y corte el cráneo haciendo una incisión lateral hacia el lado, y luego corte todo alrededor del cráneo de la cabeza. Para recuperar la parte dorsal del cráneo, utilice un fórceps fino y recto para levantar cuidadosamente la parte dorsal del cráneo.
Luego introduzca cuidadosamente los fórceps entre el cráneo ventral y el cerebro. Voltee suavemente el cerebro y corte los nervios ópticos y trigéminos con tijeras pequeñas. A continuación, gire la cabeza o la parte dorsal del cráneo boca abajo justo por encima de un plato de cultivo celular de 60 milímetros que contiene un medio de disección de frío helado para ayudar al cerebro a caer por gravedad.
Usando fórceps finos, orienta el cerebro con el lado dorsal hacia arriba y el lado ventral acostado. Bajo el microscopio binocular, utilice los fórceps finos y rectos para inmovilizar el cerebro en el lado del antebrazo. Luego, separa el cerebro trasero del resto del cerebro.
Cortar los pedúnculos cerebelosos debajo del cerebelo para separar el cerebelo del resto del cerebro trasero. Una vez que el cerebelo esté aislado, utilice fórceps finos y rectos para desgarrar cuidadosamente las meninges. Sujete el cerebelo suavemente con los fórceps finos y curvos y colóquelo con el lado dorsal hacia arriba sobre la plataforma de plástico, perpendicularmente a la cuchilla de afeitar del helicóptero.
A continuación, con una punta de pipeta de extremo estéril y delgada unida a una pipeta de un mililitro, aspira cualquier acceso al medio de disección alrededor del cerebelo. Luego, con un helicóptero de tejido, corte secciones saggitales de 300 micrómetros de espesor del cerebelo. A continuación, agregue una gota de medio de disección en el cerebelo en rodajas suavemente.
Luego, con una punta ancha de pipeta de jabalí unida a la pipeta de un mililitro, aspira lentamente el cerebelo en rodajas y transfiéralo de nuevo al plato de cultivo celular de 60 milímetros que contiene el medio de disección de frío helado. A continuación, utilice dos fórceps finos y rectos para separar las rodajas individuales. A continuación, con una punta ancha de pipeta de jabalí unida a la pipeta de un mililitro, transfiera hasta cuatro rebanadas seleccionadas del vermis, junto con algún medio de disección en un inserto de cultivo de una placa de seis pozos.
Retire cualquier acceso del medio de disección alrededor de las rodajas utilizando una punta de pipeta de extremo fino. Para la desmielinización, retire todo el medio de cultivo por debajo de los insertos de cultivo después de seis días in vitro, y reemplácelo por un mililitro por pozo del medio de cultivo fresco precalentado que contenga 0,5 miligramos por mililitro de LPC. Incubar de 15 a 17 horas a 37 grados centígrados en un 5% de ambiente de dióxido de carbono.
Después de la incubación, lave los insertos colocándolos en un plato de 25 mililitros Petri que contenga un mililitro de medio de cultivo precalentó. A continuación, transfiera inmediatamente las inserciones de cultivo en un nuevo plato de seis pozos, que contiene un medio de cultivo fresco y precalentado. Para comenzar la inmunohistoquímica, primero use fórceps para levantar inserciones de cultivo y eliminar el medio de cultivo debajo de ellos.
A continuación, agregue dos mililitros de 4%PFA en 1x PBS, ph 7.4, en las inserciones de membrana para fijar las rodajas de cerebeloso. Después de 30 minutos, lave las rodajas tres veces con dos mililitros de 1x PBS durante 10 minutos cada lavado. A continuación, bajo el microscopio binocular, usando un aumento de 25x a 30x, utilice un bisturí o un cepillo para separar suavemente las rodajas de las inserciones de membrana.
Luego, usa un cepillo para transferir las rodajas flotantes a los pozos de una placa de cuatro pozos, que contiene 1x PBS para limitar el consumo de anticuerpos. Luego, aspirar el PBS de cada pozo e incubar las rodajas en etanol preenfriado 100% a menos 20 grados Celsius durante 15 a 20 minutos. Después de la incubación, aspirar el 100% de etanol y lavar las rodajas brevemente con 1x PBS.
Luego, lávelos dos veces a temperatura ambiente con 1x PBS durante 10 minutos cada lavado. Para bloquear sitios de fijación de anticuerpos no específicos, aspire el PBS e incubar las rodajas en una solución que contenga 1x PBS, 5%NGS y 0,3% detergente no iónico a temperatura ambiente durante 30 a 45 minutos. A continuación, agregue anticuerpos primarios diluidos en la solución de bloqueo e incubar las rodajas a cuatro grados centígrados durante la noche.
Después de la incubación durante la noche, lave las rodajas tres veces con 1x PBS durante 10 minutos cada lavado. A continuación, agregue los anticuerpos secundarios, diluidos en la solución de bloqueo, en una relación de dilución de uno a 500 e incubar las rodajas a temperatura ambiente en la oscuridad durante tres horas. Después de la incubación con el anticuerpo secundario, lave las rodajas tres veces en 1x PBS en la oscuridad durante 10 minutos cada lavado.
A continuación, bajo un microscopio binocular, coloque 100 microleters de 1x PBS en la diapositiva y con un cepillo, transfiera las rodajas en el PBS y aplanarlas en la diapositiva. Quite cualquier acceso de PBS. Por último, coloque una gota de medio de montaje directamente sobre el resbalón de la cubierta de vidrio y cubra suavemente las rodajas.
Se observaron inmunotenciones de mielina en rodajas de cerebelosa organotípicas, obtenidas de los días post natales 9 a 10 C57 negros seis ratones de tipo salvaje a los 11 días in vitro con nodos de ronviae enriquecidos en canales de sodio cerrados por tensión, flanqueados por el dominio de unión axoglial paranodal. Se observaron los mismos resultados para los ratones transgénicos PLP-GFP. La mielinización de las células parkengy se logra principalmente después de una semana en el cultivo.
El tratamiento con LPC desmielina completamente las rodajas, que remilinan espontáneamente y están completamente mielinadas seis días después de la desmielinización. Este procedimiento debe tardar 25 minutos como máximo. Es realmente el punto más crítico.
El cultivo de rebanadas organotípicas es adecuado para el estudio por imágenes en vivo de la dinámica de mielinización. También se puede utilizar para apuntar a experimentos de detección de drogas. Esta técnica permite un enfoque fácil y cuantitativo para estudiar los procesos de mielinización y reeyelinación.
Los experimentadores deben seguir los procedimientos básicos de seguridad que se aplican al bienestar animal, la mielinización excesiva y aguda.
