שיטה זו מאפשרת ללמוד את המנגנון הבסיסי של מילינג ורמיאלציה ברמה התאית והטיסולרית. טכניקה זו נמצאת בצומת דרכים בין תרבויות ראשוניות וגישות vivo. זהו מודל מהיר ונגיש עם היתרון העיקרי של שמירה על ארכיטקטורת הרקמה.
הפגנת ההליך תהיה מלינה ת'יות, פוסט דוקטורנטית ורמי רונאזאנו, דוקטורנטית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להכניס מספריים קטנים בעדינות לתוך מגנום foramen לחתוך את הגולגולת על ידי ביצוע חתך צדי אחד לכיוון הצד, ולאחר מכן לחתוך סביב כל גולגולת הראש. כדי לאחזר את החלק הגבי של הגולגולת, השתמש במטס דק וישר כדי להרים בזהירות את החלק הגבי של הגולגולת.
ואז בזהירות להציג את המדפים בין גולגולת הגחון והמוח. בעדינות להעיף את המוח לחתוך את העצבים האופטיים והטריגמינליים עם מספריים קטנים. לאחר מכן, סובב את הראש או את החלק הגבי של הגולגולת במהופך ממש מעל צלחת תרבות תאים של 60 מילימטר המכילה מדיום ניתוח קר כקרח כדי לעזור למוח לרדת בכוח הכבידה.
באמצעות מטלות עדין, לכוון את המוח עם הצד הגבי פונה כלפי מעלה ואת הצד הגחוני בשכיבה. מתחת למיקרוסקופ המשקפת, השתמש במקלות ישרות עדינות כדי לשתק את המוח בצד הקדמה. לאחר מכן, הפרד את המוח האחורי משאר המוח.
חותכים את peduncles המוח הקטן מתחת למוח הקטן כדי להפריד את המוח הקטן משאר המוח האחורי. לאחר המוח הקטן מבודד, להשתמש עדין, מדפים ישר לקרוע בזהירות את קרום המוח. החזיקו את המוח הקטן בעדינות עם המדפים העדינים והמסובבים וה מניחים אותו עם הצד הגבי למעלה על גבי פלטפורמת הפלסטיק, בניצב אל סכין הגילוח של המסוק.
לאחר מכן, עם קצה סטרילי, קצה דק פיפטה מחובר פיפטה מיליליטר אחד, שאפו כל גישה של מדיום ניתוח סביב המוח הקטן. לאחר מכן, עם מסוק רקמות, פרוסה 300 מיקרומטר עבה קטעים saggital של המוח הקטן. לאחר מכן, מוסיפים טיפה של מדיום ניתוח על המוח הקטן פרוס בעדינות.
לאחר מכן, עם קצה פיפטה חזיר רחב מחובר פיפטה מיליליטר אחד, לאט שאפו את המוח הקטן פרוס ולהעביר אותו בחזרה לתוך צלחת תרבות התא 60 מילימטר המכיל קרח קר ניתוח בינוני. לאחר מכן, השתמשו בשני מדפים ישרים עדין כדי להפריד פרוסות בודדות. לאחר מכן, עם קצה פיפטה חזיר רחב מחובר פיפטה מיליליטר אחד, להעביר עד ארבע פרוסות נבחרות מן vermis, יחד עם כמה מדיום ניתוח על הכנס תרבות אחת של צלחת שש היטב.
הסר כל גישה של מדיום ניתוח סביב הפרוסות באמצעות קצה דק טיפט. עבור demyelination, להסיר את כל התרבות בינוני מתחת לתרבות מכניס לאחר שישה ימים במבחנה, ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד ל הבאר של אמצעי תרבות טרום מחומם, טרי המכיל 0.5 מיליגרם למיליליטר LPC. דגירה במשך 15 עד 17 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה 5%פחמן דו חמצני.
לאחר הדגירה, לשטוף את המכניסים על ידי הצבת אותם בצלחת פטרי 25 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של מדיום תרבות מחומם מראש. לאחר מכן, מיד להעביר את התרבות מכניסה חדש, שישה צלחת גם, המכיל טרי, מדיום תרבות מחומם מראש. כדי להתחיל אימונוהיסטוכימיה, ראשית להשתמש במטסים כדי להרים את התרבות מכניס ולהסיר את מדיום התרבות מתחתיהם.
לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של 4%PFA ב 1x PBS, ph 7.4, על מוסיף קרום כדי לתקן את פרוסות המוח הקטן. לאחר 30 דקות, לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים עם שני מיליליטר של 1x PBS במשך 10 דקות כל לשטוף. לאחר מכן, מתחת למיקרוסקופ המשקפת, באמצעות הגדלה של פי 25 עד 30, השתמש באזמל או במברשת כדי לנתק בעדינות את הפרוסות ממוסיף הממברנה.
לאחר מכן, השתמש במברשת כדי להעביר את הפרוסות הצפות לתוך בארות של צלחת ארבע בארות, המכיל 1x PBS כדי להגביל את צריכת הנוגדנים. לאחר מכן, שאפו את ה-PBS מכל באר והדקרו את הפרוסות באתנול מקורר מראש של 100% במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 20 דקות. לאחר הדגירה, שאפו את האתנול 100% ושטפו את הפרוסות לזמן קצר עם פיב"ג אחד.
לאחר מכן, לשטוף אותם פעמיים בטמפרטורת החדר עם 1x PBS במשך 10 דקות כל לשטוף. כדי לחסום אתרי קיבוע נוגדנים לא ספציפיים, שאפו את ה-PBS והדקרו את הפרוסות בתתב"ג המכיל 1x PBS, 5%NGS ו-0.3% חומר ניקוי יוני בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 45 דקות. לאחר מכן, מוסיפים נוגדנים ראשוניים מדוללים בתפיסת החסימה ומדגרים את הפרוסות בארבע מעלות צלזיוס בן לילה.
לאחר הדגירה לילה, לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים עם 1x PBS במשך 10 דקות כל לשטוף. לאחר מכן מוסיפים את הנוגדנים המשניים, מדוללים בתפיסת החסימה, ביחס דילול של 1 עד 500 ומדגרים את הפרוסות בטמפרטורת החדר בחושך במשך שלוש שעות. לאחר הדגירה עם הנוגדן המשני, לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים ב 1x PBS בחושך במשך 10 דקות כל לשטוף.
לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ משקפת, מניחים 100 מיקרולטרים של PBS 1x על השקופית עם מברשת, להעביר את הפרוסות לתוך PBS ולשטח אותם על השקופית. הסר כל גישה של PBS. לבסוף, מניחים טיפה של מדיום הרכבה ישירות על החלקת מכסה הזכוכית בעדינות לכסות את הפרוסות.
immunostainings Myelin בפרוסות המוח הקטן organotypic, המתקבל ימים שלאחר הלידה 9 עד 10 C57 שחור שישה עכברים מסוג בר נצפו ב 11 ימים במבחנה עם צמתים של ronviae מועשר בתמי נתרן מגודר מתח, מוקף על ידי תחום צומת אקסוגליאלי עלה. אותן תוצאות נצפו עבור עכברים מהופנטים PLP-GFP. מילינג של תאי parkengy מושגת בעיקר לאחר שבוע בתרבות.
טיפול LPC demyelinates באופן מלא את הפרוסות, אשר remyelinate באופן ספונטני והם מיילין מלא שישה ימים לאחר demyelination. הליך זה צריך לקחת 25 דקות לכל היותר. זו באמת הנקודה הקריטית ביותר.
תרבות פרוסות אורגנוטיפיק מתאימה לחקר הדמיה חיה של דינמיקת המיאלציה. זה יכול לשמש גם עבור מיקוד ניסויים הקרנת סמים. טכניקה זו מאפשרת גישה קלה וכמותית לחקר תהליכי מילינג ורמיאלציה.
על הניסויים לפעול על פי נהלי הבטיחות הבסיסיים החלים על רווחת בעלי החיים, מיאלציה מוגזמת וחדה.
