この方法は、細胞およびtissularレベルでの髄鞘化および再髄鞘の基本的なメカニズムを研究することを可能にする。この技術は、主要な文化とインビボアプローチの間の交差点にあります。それはティッシュの建築を維持する主な利点がある速く、アクセス可能なモデルである。
この手順を実証するには、博士研究員のメリナ・テティオットと、私の研究室の博士課程の学生であるレミ・ロンツァーノです。まず、小さなはさみを奥マグナムにそっと挿入し、側面に向かって1つの横切開を行って頭蓋骨を切り、頭の頭蓋骨の周りを切ります。頭蓋骨の後ろ側部分を取り出すために、細かいストレートな鉗子を使用して頭蓋骨の後ろ側部分を慎重に持ち上げます。
その後、慎重に腹側の頭蓋骨と脳の間の鉗子を導入します。脳をそっとひっくり返し、小さいはさみで視神経と三叉神経を切り取ります。次に、頭蓋骨の頭または背側部分を氷冷解離培地を含む60ミリメートルの細胞培養皿のすぐ上に逆さまにして、脳が重力によって低下するのを助けます。
細かい鉗子を使用して、後側を上に向け、腹側を横たわって脳を向きます。双眼鏡顕微鏡の下で、細かいストレート鉗子を使用して、前脳側の脳を固定化します。その後、後ろの脳を脳の残りの部分から分離します。
小脳の下の小脳のペダンクを切り取り、小脳を後ろの脳の残りの部分から分離する。小脳が隔離されたら、細かいストレートな鉗子を使って髄を慎重に引き裂きます。細かい湾曲した鉗子で小脳をそっと持ち、チョッパーカミソリの刃に垂直に、背側をプラスチックプラットフォームに上げます。
次に、1ミリリットルのピペットに付着した無菌の薄いエンドピペットチップを用いて、小脳の周りの解剖媒体の任意のアクセスを吸引する。次いで、組織チョッパーを用いて、小脳の厚さ300マイクロメートルのたるみ部分をスライスする。次に、スライスした小脳に解剖媒体を少し加えます。
次に、1ミリリットルのピペットに広いイノシシピペットチップを取り付けた状態で、スライスした小脳をゆっくりと吸引し、氷冷解剖培地を含む60ミリメートルの細胞培養皿に戻す。次に、2つの細かいストレート鉗子を使用して、個々のスライスを分離します。次に、1ミリリットルのピペットに広いイノシシピペットチップを取り付けた状態で、樹皮から最大4つの選択したスライスを、いくつかの解剖媒体と共に6つのウェルプレートの1つの培養インサートに移す。
薄い端のピペットの先端を使用してスライスの周りの解剖媒体のアクセスを取り除きます。脱髄のために、6日後に培養インサートの下のすべての培養培地を取り除き、1ミリリットルLPCあたり0.5ミリグラムを含む予め温めた新鮮な培養培地のウェルあたり1ミリリットルに置き換える。5%の二酸化炭素環境で摂氏37度で15〜17時間インキュベートします。
インキュベーション後、1ミリリットルの予温培養培地を含む25ミリリットルのペトリ皿に入れて、インサートを洗浄します。次いで、新しい6つのウェルプレートに培養インサートを直ちに移し、新鮮で、あらかじめ温めた培養液を含む。免疫検査を始めるには、まず鉗子を使って培養インサートを持ち上げ、その下の培養培地を取り除きます。
次に、1x PBSに4%PFAの2ミリリットルを加え、ph7.4を膜に挿入して小脳スライスを固定する。30分後、スライスを1回10分間1倍PBSの2ミリリットルで3回洗います。次に、両眼顕微鏡下で、25倍から30倍の倍率を使用し、メスまたはブラシを使用して、膜インサートからスライスをそっと取り外します。
次に、ブラシを使用して、浮遊スライスを4つのウェルプレートのウェルに移し、1x PBSを含んで抗体の消費を制限します。次に、各ウェルからPBSを吸引し、15〜20分間マイナス20度で予冷100%エタノールでスライスをインキュベートする。インキュベーション後、100%エタノールを吸引し、スライスを1x PBSで短時間洗浄します。
その後、1回10分間PBSで室温で2回洗浄します。非特異的抗体固定部位をブロックするには、PBSを吸引し、1x PBS、5%NGS、および0.3%非イオン性洗剤を含む溶液中のスライスを30〜45分間インキュベートします。次に、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体を加え、一晩で摂氏4度でスライスをインキュベートします。
一晩のインキュベーションの後、スライスを1回10分間PBSで3回洗います。次いで、二次抗体を加え、ブロッキング溶液中で希釈し、1〜500希釈比で、室温でスライスを暗闇の中で3時間インキュベートする。二次抗体でインキュベーションした後、1回の洗浄を10分間暗闇の中で1x PBSで3回洗浄します。
次に、双眼鏡顕微鏡の下で、スライドに1x PBSの100マイクロレターを置き、ブラシでスライスをPBSに移し、スライド上でそれらを平らにします。PBS のアクセス権を削除します。最後に、取り付け媒体を直接ガラスカバースリップに置き、スライスをそっと覆います。
野生性小脳切片中のミエリン免疫染色は、出生後9日から10日にかけて得られた黒6型野生型マウスを、電圧ゲートナトリウムチャネルに富化したロンビアの節を有するインビトロで11日間で観察し、パラノダルアキソール接合ドメインに横たわった。PLP-GFPトランスジェニックマウスでも同様の結果が認められた。パーケンシー細胞の髄鞘化は、主に培養で1週間後に達成される。
LPC治療は、自然に再髄化し、脱髄後6日間完全に髄鞘化されるスライスを完全に脱髄する。この手順は最大で 25 分かかります。それは本当に最も重要なポイントです。
オルガノミピックスライス培養は、髄鞘化ダイナミクスのライブイメージング研究に適しています。また、薬物スクリーニング実験を標的にするために使用することができます。この技術は、髄鞘化および再髄化プロセスを研究するための簡単で定量的なアプローチを可能にする。
実験者は、動物の福祉、過剰で鋭い髄鞘に適用される基本的な安全手順に従う必要があります。
