Preparación de gránulos Gushukang (GSK) para experimentos in Vivo e In Vitro

Este protocolo proporciona la preparación de una solución de trabajo de gránulos para estudios in vivo, así como la preparación de suero que contiene gránulos para experimentos in vitro. Una ventaja de esta técnica es que el método se puede repetir fácilmente debido al bajo costo de los materiales y los animales que creas para los experimentos. Comience agregando ocho, 16 y 24 gramos de gránulos De Gushukang, o GSK, a tubos individuales de 50 mililitros.

Añadir 48 mililitros de agua a cada tubo, y agitar los tubos para disolver completamente los gránulos. Luego, coloque 1,6 comprimidos de carbonato de calcio suplementados con vitamina D3 en otro tubo de 50 mililitros, y disuelva los comprimidos en 48 mililitros de solución salina con agitación. Para la administración intragástrica de las soluciones, primero sujetar manualmente un ratón C57 Black 6 de un mes de edad durante dos o tres minutos.

Cuando el ratón se haya calmado, cargue una aguja de 40 milímetros número 12 con 0,24 mililitros de una solución de trabajo de gránulos GSK, y coloque la aguja de gavage en el ratón a través de un lado de su boca hasta que se sienta la resistencia de la aguja, lo que indica que la aguja ha llegado al estómago. Inyectar todo el volumen de solución de trabajo en el animal. Luego, retraiga la aguja de gavage, y regrese el ratón a su jaula mientras los otros ratones están siendo administrados GSK antes de inyectar 0.24 mililitros de carbonato de calcio y solución de vitamina D3 en cada ratón de la misma manera.

Para la recolección de suero sanguíneo que contiene GSK, después de entregar las concentraciones apropiadas de GSK a una rata por gavage como acaba de demostrar, confirme una falta de respuesta al pellizco del dedo del pie una hora después de la última administración del gránulo GSK. Haz una incisión abdominal en la piel y la pertoneal, y expone el abdomen a la parte inferior del tórax. Utilice papel tisú para extraer el tejido conectivo de la aorta abdominal para exponer el vaso con claridad, y utilice una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 22 para extraer sangre de la aorta.

Transfiera la sangre a un tubo estéril de 15 mililitros y coloque el tubo en posición vertical a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. Cuando la sangre se haya coagulado, centrifuga el tubo para separar el suero y transfiera todo el suero de hasta seis ratas a un nuevo tubo de 50 mililitros. Agitar el tubo para mezclar el suero antes de inactivar los componentes del suero en un baño de agua Celsius de 56 grados durante 30 minutos.

Luego, filtre el suero a través de un filtro de jeringa de poliétersulfone hidrófilo de 0,22 micrómetros de tamaño poro para almacenarlo a menos 80 grados centígrados durante un año. Para la osteoclastogénesis in vitro, diluir las tres dosis de suero que contiene GSK en una proporción de uno a cuatro con medio mínimo de águila complementado con L-glutamina, ribonucleósidos, y desoxirribonucleósidos. Añadir 200 microlitros de cada dilución a cada pozo de un cultivo de macrófagos de médula ósea en una placa de 96 pocillos.

A continuación, inicie la generación de osteoclastos estimulando cada pozo con el factor estimulante de colonias de macrófagos y el activador del receptor para el ligando del factor nuclear-kappa B. Para la osteoblastogénesis in vitro, añadir dos mililitros de suero diluido que contenga GSK a cada pozo de un cultivo de células madre mesenquimales óseas de placa de 24 pozos. Los resultados de la exploración por tomografía microcóctida indican que los ratones ovariectomizados demuestran una pérdida ósea significativa en comparación con los ratones de control salino.

La intervención con 90 días de tratamiento gránulo GSK aumenta considerablemente la densidad de la médula ósea, particularmente en animales tratados con GSK en dosis medias. El tratamiento con gránulos GSK también conduce a un aumento del número de hueso trabecular, volumen óseo sobre el volumen total y espesor óseo trabecular, pero una disminución de la separación ósea-trabecular ósea. La tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato, o TRAP, revela un aumento en el número de osteoclastos en ratones ovariectomizados en comparación con los animales de control, mientras que los tratamientos de gránulos GSK reducen la diferenciación de osteoclastos positivas de TRAP en comparación con los animales ovariectomizados.

El suero que contiene gránulos GSK también reduce el número de osteoclastos positivos trap en comparación con el suero recogido de los animales de control. La penetración exitosa de la aguja en la aorta abdominal es fundamental para garantizar que se extrae sangre de volumen suficientemente alto de cada rata. Una ejecución exitosa de este método debe asignar la acumulación de 15 a 20 milímetros de sangre, suficiente material para ser utilizado para experimentos in vitro.