Préparation des granules de Gushukang (GSK) pour les expériences in vivo et in vitro

Ce protocole prévoit la préparation d’une solution de travail de granules pour les études in vivo, ainsi que la préparation de sérum contenant du granule pour des expériences in vitro. Un avantage de cette technique est que la méthode peut être facilement répétée en raison du faible coût des matériaux et des animaux que vous créez pour les expériences. Commencez par ajouter huit, 16 et 24 grammes de granules Gushukang, ou GSK, à des tubes individuels de 50 millilitres.

Ajouter 48 millilitres d’eau à chaque tube et secouer les tubes pour dissoudre complètement les granules. Ensuite, placez 1,6 comprimé de carbonate de calcium complété par de la vitamine D3 dans un autre tube de 50 millilitres, et dissoudre les comprimés en 48 millilitres de solution saline avec secousses. Pour l’administration intragastrique des solutions, d’abord doucement mais fermement retenir manuellement un mois, femelle, C57 Noir 6 souris pendant deux à trois minutes.

Lorsque la souris s’est calmée, chargez une aiguille de gavage numéro 12 de 40 millimètres avec 0,24 millilitres d’une solution de travail de granules GSK et placez l’aiguille de gavage dans la souris d’un côté de sa bouche jusqu’à ce que la résistance à l’aiguille soit ressentie, ce qui indique que l’aiguille a atteint l’estomac. Injectez tout le volume de solution de travail dans l’animal. Puis, rétractez l’aiguille de gavage, et retournez la souris dans sa cage pendant que les autres souris sont administrées GSK avant d’injecter 0,24 millilitres de carbonate de calcium et de vitamine D3 solution dans chaque souris de la même manière.

Pour la collecte de sérum sanguin contenant gsk, après avoir livré les concentrations appropriées de GSK à un rat par gavage comme vient de le démontrer, confirmer un manque de réponse à pincement des pieds une heure après la dernière administration granule GSK. Faire une peau abdominale et une incision péritonéale, et exposer l’abdomen au fond du thorax. Utilisez du papier de soie pour enlever le tissu conjonctif de l’aorte abdominale pour exposer clairement le vaisseau, et utilisez une seringue de 10 millilitres équipée d’une aiguille de calibre 22 pour prélever le sang de l’aorte.

Transférer le sang dans un tube stérile de 15 millilitres et placer le tube à la température ambiante pendant 30 à 60 minutes. Lorsque le sang a coagulé, centrifuger le tube pour séparer le sérum, et transférer tout le sérum pour un jusqu’à six rats dans un nouveau tube de 50 millilitres. Secouez le tube pour mélanger le sérail avant d’inactiver les composants du sérum dans un bain d’eau de 56 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Filtrez ensuite le sérum à l’aide d’un filtre à seringues hydrophiles polyéthersulfone de taille 0,22 micromètre-pore pour un stockage à moins 80 degrés Celsius jusqu’à un an. Pour l’ostéoclastogenèse in vitro, diluer les trois doses de sérum contenant GSK à un rapport d’un à quatre avec un minimum eagle’s moyen complété avec L-glutamine, ribonucleosides, et deoxyribonucleosides. Ajouter 200 microlitres de chaque dilution à chaque puits d’une culture macrophage de moelle osseuse dans une plaque de 96 puits.

Puis, initier la génération ostéoclaste en stimulant chaque puits avec macrophage colonie stimulant facteur et activateur récepteur pour le facteur nucléaire kappa B ligand. Pour l’ostéoblastogenèse in vitro, ajoutez deux millilitres de sérum dilué contenant GSK à chaque puits d’une culture mésenchymale de cellules souches mésenchymales d’os de plaque de 24 puits. Les résultats de balayage de tomographie micro-calculée indiquent que les souris ovariectomized démontrent la perte significative d’os comparée aux souris salines de contrôle.

L’intervention avec 90 jours de traitement de granule de GSK augmente considérablement la densité de moelle, particulièrement chez les animaux GSK-traités à dose moyenne. Le traitement de granule de GSK mène également à un nombre trabecular accru d’os, au volume d’os au-dessus du volume total, et à l’épaisseur trabecular d’os, mais à une séparation diminuée d’os os-trabecular. La coloration à l’acide résistante au tartrate, ou TRAP, révèle une augmentation du nombre d’ostéoclastes chez les souris ovariectomisées par rapport aux animaux témoins, tandis que les traitements de granules GSK diminuent la différenciation ostéoclaste trap-positive par rapport aux animaux ovariectomisés.

Le sérum contenant du granule GSK réduit également le nombre d’ostéoclastes positifs au TRAP par rapport au sérum prélevé sur les animaux de contrôle. La pénétration réussie de l’aiguille dans l’aorte abdominale est essentielle pour garantir qu’un volume suffisamment élevé de sang est récolté à partir de chaque rat. Une exécution réussie de cette méthode devrait attribuer l’accumulation de 15 à 20 millimètres de sang, suffisamment de matériel pour être utilisé pour des expériences in vitro.