이 프로토콜은 생체 내 연구를 위한 과립의 작업 용액의 준비뿐만 아니라 체외 실험을 위한 과립 함유 혈청의 준비를 갖추고 있습니다. 이 기술의 한 가지 장점은 실험에 대해 생성하는 재료와 동물의 저렴한 비용으로 인해 방법을 쉽게 반복 할 수 있다는 것입니다. 8그램, 16그램, 24그램의 구수강 또는 GSK를 개별 50밀리리터 튜브에 첨가하여 시작합니다.
각 튜브에 48밀리리터의 물을 넣고 튜브를 흔들어 과립을 완전히 녹입니다. 그런 다음 비타민 D3로 보충된 탄산칼슘 1.6정을 또 다른 50밀리리터 튜브에 넣고, 탈염기 48밀리리터에 정제를 녹입니다. 솔루션의 위장 투여를 위해 먼저 1개월 된 여성 C57 Black 6 마우스를 2~3분 동안 부드럽게 억제합니다.
마우스가 진정되면, GSK 과립의 한 작업 용액의 0.24 밀리리터가 있는 40밀리미터, 번호 12 개바게 바늘을 적재하고, 바늘 저항이 느껴지기 전까지 마우스에 개간 바늘을 배치하여 바늘이 위장에 도달했음을 나타낸다. 작업 용액의 전체 볼륨을 동물에 주입합니다. 이어서, 개비지 바늘을 회수하고, 마우스를 케이지로 되돌리고, 다른 마우스가 GSK를 투여하는 동안 각 마우스에 탄산칼슘과 비타민 D3 용액을 동일한 방식으로 주입한다.
GSK 함유 혈액 혈청 수집의 경우, 방금 입증된 바와 같이 개비지에 의한 GSK의 적절한 농도를 쥐에 전달한 후, 마지막 GSK 과립 투여 후 1시간 후에 발가락 꼬집어에 대한 반응부족을 확인한다. 복부 피부와 복막 절개를 하고 복부를 흉부 바닥에 노출시십시오. 티슈 페이퍼를 사용하여 복부 대어타의 결합 조직을 제거하여 혈관을 명확하게 노출시키고 대어타에서 혈액을 끌어들이기 위해 22 게이지 바늘을 장착한 10 밀리리터 주사기를 사용합니다.
혈액을 멸균 15 밀리리터 튜브로 옮기고 튜브를 실온에서 30~60분 동안 똑바로 세워 놓습니다. 혈액이 응고되면 튜브를 원심분리하여 혈청을 분리하고 최대 6마리의 쥐를 새로운 50밀리리터 튜브로 옮기습니다. 튜브를 흔들어 혈청 성분을 활성화하기 전에 56도 의 수조에서 30 분 동안 세레고 성분을 혼합하십시오.
이어서, 0.22 마이크로미터-공극식 포머 크기의 폴리테셔술폰 주사기 필터를 통해 혈청을 최대 1년 동안 영하 80도까지 보관한다. 체외 골세포 신생의 경우, L-글루타민, 리보뉴클레오시드 및 데옥시리보뉴클레오시드로 보충된 최소 독수리의 배지로 1 대 4 비율로 GSK 함유 혈청의 3가지 투여량을 희석시합니다. 96웰 플레이트에 골수 대식파지 배양의 각 웰에 각 희석제 200마이크로리터를 추가합니다.
이어서, 핵인자-카파 B 리간드에 대한 대식세포 식민지 자극 인자 및 수용체 활성제로 각각을 잘 자극하여 골세포 생성을 개시한다. 체외 골세포 발생의 경우, 24웰 플레이트 뼈 중간엽 줄기 세포 배양의 각 웰에 희석 된 GSK 함유 혈청의 2 밀리리터를 추가합니다. 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영 스캐닝 결과는 ovaictomized 마우스가 식염수 대조군 마우스에 비해 상당한 뼈 손실을 입증한다는 것을 나타냅니다.
GSK 과립 치료의 90 일 내정간섭은 골수 조밀도를 크게 증가, 특히 중간 용량 GSK 처리 동물. GSK 과립 치료는 또한 증가 된 반관 골 수로 이끌어 내고, 총 부피에 뼈 부피, 및 반경 골 두께를 증가하되, 그러나 감소된 뼈-반경 골 분리. 타르타르트 내성 산인산인산염 또는 TRAP, 염색은 대조군 동물에 비해 소뇌마우스의 골세포 수가 증가하고, GSK 과립 치료는 암소암화 동물에 비해 트랩 양성 골세포 분화를 감소시다.
GSK 과립 함유 혈청은 또한 대조군 동물로부터 수집된 혈청에 비해 TRAP 양성 골의 수를 감소시킨다. 복부 대오르타로 바늘의 성공적인 침투는 각 쥐에서 충분한 양의 혈액이 수확되는 것을 보장하기 위해 중요합니다. 이 방법의 성공적인 실행은 15 에서 20 밀리미터의 혈액축적을 할당해야하며, 체외 실험에 사용할 수있는 충분한 물질.
