Bu protokol, in vivo çalışmalar için granüllerin çalışma çözeltisinin hazırlanmasını ve in vitro deneyler için granül içeren serumun hazırlanmasını sağlar. Bu tekniğin bir avantajı, deneyler için oluşturduğunuz malzemelerin ve hayvanların düşük maliyeti nedeniyle yöntemin kolayca tekrarlanabiliyor olmasıdır. Arta sekiz, 16 ve 24 gram Gushukang veya GSK, granülleri tek tek 50 mililitrelik tüpler ekleyerek başlayın.
Her tüpe 48 mililitre su ekleyin ve granülleri tamamen eritmek için tüpleri sallayın. Daha sonra, başka bir 50 mililitrelik tüp içine D3 vitamini ile desteklenen kalsiyum karbonat 1.6 tablet yerleştirin ve sallayarak tuzlu 48 mililitre tablet eritin. Çözümlerin intragastrik yönetimi için, ilk olarak hafifçe ama sıkıca elle bir aylık, kadın, C57 Siyah 6 fare iki ila üç dakika boyunca dizginlemek.
Fare sakinleştiğinde, GSK granüllerinin bir çözeltisinin 0,24 mililitrelik 12 numaralı gavaj iğnesini yükleyin ve iğne direnci hissedilene kadar gavaj iğnesini ağzının bir tarafından fareye yerleştirin ve iğnenin mideye ulaştığını gösterin. Çalışma çözeltisinin tüm hacmini hayvana enjekte edin. Daha sonra, gavaj iğnesini geri alın ve diğer fareler e-posta ile 0,24 mililitre kalsiyum karbonat ve D3 vitamini çözeltisini aynı şekilde fareye enjekte etmeden önce GSK uygulanırken fareyi kafesine geri getirin.
GSK içeren kan serumu toplama için, gsk uygun konsantrasyonları teslim ettikten sonra gavage tarafından bir sıçana sadece gösterildiği gibi, son GSK granül uygulamasından bir saat sonra parmak kıskacına yanıt eksikliğini onaylayın. Bir karın deri ve periton kesi olun, ve toraks altına karın maruz. Açıkça damar ortaya çıkarmak için karın aort bağ dokusu kaldırmak için doku kağıt kullanın, ve aort kan çekmek için 22-gauge iğne ile donatılmış bir 10 mililitrelik şırınga kullanın.
Kanı steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpü oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika dik olarak yerleştirin. Kan pıhtılaştığında, serumu ayırmak için tüpü santrifüj edin ve altı fareye kadar tüm serumu 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Serum bileşenlerini 56 derecelik bir su banyosunda 30 dakika boyunca etkisiz hale getirerek serayı karıştırmak için tüpü sallayın.
Daha sonra serumu 0,22 mikrometre büyüklüğünde hidrofilik polyethersulfone şırınga filtresinden filtreleyin ve bir yıla kadar eksi 80 santigrat derecede depolayın. In vitro osteoklastogenez için, En az Eagle orta L-glutamin ile takviye ile bir-dört oranında GSK içeren serum üç doz seyreltmek, ribonükleozitler, ve deoksiribonükleozitler. 96 kuyuluk bir tabaktaki kemik iliği makrofaj kültürünün her kuyuya her seyreltmenin 200 mikrolitresini ekleyin.
Daha sonra, nükleer faktör-kappa B ligand için makrofaj koloni uyarıcı faktör ve reseptör aktivatör ile her iyi uyararak osteoklast nesil başlatın. In vitro osteoblastogenez için, 24-iyi plaka kemik mezenkimal kök hücre kültürünün her kuyusu seyreltilmiş GSK içeren serum iki mililitre ekleyin. Mikro-bilgisayarlı tomografi tarama sonuçları ovariektomized fareler tuzlu kontrol farelere göre önemli kemik kaybı gösterdiğini göstermektedir.
90 günlük GSK granül tedavisiile yapılan müdahale, özellikle orta doz GSK ile tedavi edilen hayvanlarda kemik iliği yoğunluğunu büyük ölçüde artırır. GSK granül tedavisi de artmış trabeküler kemik sayısıyol açar, toplam hacim üzerinde kemik hacmi, ve trabeküler kemik kalınlığı, ancak azalmış kemik-trabeküler kemik ayrılması. Tartatata dirençli asit fosfataz veya TRAP, boyama, kontrol hayvanlarına göre ovariectomized farelerde osteoklast sayısında bir artış ortaya koymaktadır, GSK granül tedavileri ovariectomized hayvanlara göre TRAP pozitif osteoklast farklılaşmasını azaltır.
GSK granül içeren serum, kontrol hayvanlarından toplanan seruma göre TRAP pozitif osteoklast sayısını da azaltır. İğnenin abdominal aort içine başarılı bir şekilde girmesi, her sıçandan yeterince yüksek hacimli bir kan topladığını garanti etmek için çok önemlidir. Bu yöntemin başarılı bir şekilde uygulanması, 15 ila 20 milimetre kan birikimini, in vitro deneylerde kullanılacak yeterli malzemeyi tahsis etmelidir.
