Aunque se han realizado estudios sobre la pérdida de audición inducida por el ruido, ninguno ha registrado el método con tanto detalle, lo que lo convierte en un procedimiento importante. Este método causó efectivamente la pérdida de audición inducida por el ruido en ratones, y observa los cambios reales en el umbral de audición por ABR. Un modelo animal de pérdida auditiva inducida por ruido es útil para que los científicos comprendan a fondo el mecanismo de la pérdida auditiva inducida por ruido y, posteriormente, optimicen las estrategias de tratamiento correspondientes.
La demostración del procedimiento estará a cargo de Dian-Shiue Lee, una estudiante muy talentosa de mi laboratorio. Para preparar la jaula para los ratones experimentales, use una jaula trampa para ratas y corte cuatro piezas de cartón corrugado en tamaños apropiados, haciendo que quepan en la jaula. Para evitar que los ratones se corten las patas con la rejilla de malla, coloque dos de las piezas en la parte inferior y en la parte posterior, respectivamente.
Coloque las otras dos piezas entrelazadas perpendicularmente entre sí, para dividir el espacio dentro de la jaula en cuartos Abra el software de la aplicación CLIO. Mueva el cursor hasta el icono del altavoz y haga clic en TwoSin. Introduzca y cambie el valor de Frecuencia 1 a 1.000 hercios, Frecuencia 2 a 6.000 hercios y haga clic en Aceptar para empezar a reproducir el sonido.
En la pestaña Leq, cambie dBV a dBSPL. Después de configurar la hora en la interfaz del software, haga clic en el botón del triángulo verde para reproducir el sonido. Coloque un micrófono frente al altavoz a una distancia de 8,5 centímetros para calibrar el nivel de ruido.
Ajuste el nivel de ruido a 125 decibelios SPL-A y monitoree continuamente durante al menos tres minutos para asegurarse de que el nivel de ruido esté suficientemente estabilizado. Utilice un generador, un analizador y un amplificador para crear y controlar el ruido. Coloque cuatro ratones machos C57 negro 6J en la jaula, uno por cada cuarto, para la exposición al ruido.
Asigne aleatoriamente los ratones a cada cuarto durante la exposición al ruido. Coloque un micrófono en la parte superior de la jaula para controlar el nivel de ruido durante la exposición al ruido. Coloque la jaula frente al altavoz dentro de una caja insonorizada, asegurándose de que el altavoz esté colocado a 8,5 centímetros de distancia de la jaula.
Exponga a los ratones al ruido a frecuencias de un kilohercio y seis kilohercios de forma continua durante seis horas al día, durante cinco días consecutivos. Mida los umbrales de audición de los ratones en los días 6 y 13 midiendo el ABR. Utilice un sistema comercial de pruebas ABR, diseñado específicamente para animales pequeños para las mediciones de ABR, y mantenga al animal bajo anestesia general.
Coloque electrodos de aguja subdérmica de 12 milímetros en el vértice detrás del pabellón auricular de la oreja izquierda y cerca de la cola para medir el umbral de audición. Después de colocar el altavoz a un centímetro de distancia de la oreja izquierda del animal, presente estímulos acústicos utilizando el altavoz. Elija Onda sinusoidal para los estímulos y 10 k para la escala de ventana.
Gire la perilla de frecuencia para obtener la frecuencia deseada de los estímulos acústicos. Ajuste la intensidad del estímulo girando la perilla AMLP en el generador de funciones. Obtenga la intensidad de estímulo deseada girando la perilla AMLP a un voltaje adecuado calculado a partir de la calibración.
Recoja las mediciones de ABR bajo una serie de intensidades de estímulo de 10 a 100 decibelios SPL, con un tamaño de paso de 10 decibelios. Marque el nivel mínimo de intensidad de estímulo que podría dar lugar a una Onda V discernible como el umbral ABR. Sacrifique los ratones después de las mediciones de ABR y extraiga las cócleas de los ratones sacrificados.
Inmediatamente después de cosechar los tejidos, sumérjalos en formaldehído al 10% para su fijación y déjelos reposar durante al menos ocho horas a cuatro grados centígrados. Utilice EDTA para la descalcificación, como se describe en el texto. Coloque las cócleas en una placa de Petri llena de PBS.
Para la tinción de tejidos, corte el órgano en forma de espiral de Corti, u OC, en tres secciones: el giro basal, el giro medio y el giro apical. Bajo un microscopio de disección con un aumento de 8x a 35x, extirpar las estructuras óseas que incluyen la rampa vestibular, la rampa timpánica y el modiolo de las cócleas descalcificadas, y obtener los tejidos blandos, incluido el OC. Se observó un aumento significativo en el umbral de audición a 12 kilohercios, 24 kilohercios y 32 kilohercios un día después de la exposición al ruido. La recuperación parcial de la audición se produjo una semana después de la exposición al ruido, pero los umbrales de audición seguían siendo elevados en más de 30 decibelios en todas las frecuencias en comparación con los grupos de control.
En este estudio, la audición estaba más dañada a altas frecuencias. Se observó una diferencia significativa en el umbral de audición entre el grupo control y el grupo experimental tanto en el 6º como en el 13º día, a 12 kilohercios y 32 kilohercios. Se observó consistentemente una pérdida de células ciliadas externas en las imágenes microscópicas adquiridas de los ratones NIHL, en comparación con las de los ratones de control.
Si bien las células ciliadas internas permanecieron intactas en todas las imágenes, las células ciliadas externas en las vueltas basales y medias del OC estaban severamente dañadas. Por el contrario, las células ciliadas externas en el giro apical estaban casi intactas. El paso más importante de este protocolo incluye la exposición al ruido, la medición del ITB y la extracción de la cóclea.
Este procedimiento se puede aplicar para investigar el efecto de la exposición al ruido a diferentes frecuencias en la pérdida auditiva mediante el uso de varios tipos de sonido.
