이러한 프로토콜은 게놈 전체 방식으로 RNA 결합 단백질 PKR의 RNA 인터액터를 식별하는 방법을 제공한다. 그것은 우리가 RNA 결합 단백질에 의한 유전자 발현의 전사 후 조절을 더 잘 이해하는 데 도움이됩니다. 이 기술의 주요 장점은 포름알데히드의 효율적인 교차 연결을 활용하여 RNA 결합 단백질에 결합된 RNase를 고치고 면역 침전을 통해 이를 풍부하게 한다는 것입니다.
활성화된 PKR는 파킨슨병과 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환 환자에서 관찰된다. PKR 상호 작용 이중 좌초 RNase를 확인하면 이러한 퇴행성 질환의 발병을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 이 방법은 RNA 결합 단백질의 RNA 인터액터를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
특히, 우리는 이 방법이 이중 좌초 RNase와 같은 구조화된 RNase를 인식하는 단백질을 연구하는 데 유용하다고 믿습니다. 세포를 수확하기 전에 주기 체포 된 샘플의 균질성을 확인하십시오. 또한, 사용 가능한 최상의 항체를 사용하여 면역 침전 효율을 최적화하는 것이 중요합니다.
시작하려면, S-또는 M 상 체포 견본을 위한 750, 000 또는 백만 HeLa 세포를 각각 종자합니다. 세포는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 증가합니다. 2 밀리머 티미딘으로 세포를 치료하고 18 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.
PBS로 셀을 두 번 씻으시면 됩니다. 그런 다음 신선한 미디어를 추가하고 9 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. S 상 체포 세포의 경우, 2 밀리머 리 미딘으로 세포를 치료하십시오.
M-위상 체포 세포의 경우, 노코다졸의 밀리리터 당 100 나노그램으로 세포를 치료하십시오. 15시간 동안 섭씨 37도에서 배양하세요. S-phase 샘플의 경우 세포 스크레이퍼로 세포를 수집하고 15밀리리터 원문 튜브로 이송합니다.
M-위상 샘플의 경우 세포 배양 접시의 측면을 탭하여 M 상 체포 세포를 분리하고 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮겨냅니다. 다음으로 실온에서 380g의 세포를 3분간 원심분리합니다. 상체를 제거하고 차가운 PBS의 1 밀리리터로 세포를 다시 중단합니다.
세포를 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 이송합니다. 세포를 섭씨 4도에서 10, 000g에서 30초 동안 원심분리하고 수퍼나티를 완전히 제거합니다. 포름알데히드 교차 연결을 수행하기 위해 먼저 세포에 0.1 % 파라 포름 알데히드의 750 마이크로 리터를 추가하고 세포를 해결하기 위해 10 분 동안 실온에서 배양합니다.
그런 다음, 1-어금니 글리신 250 마이크로리터를 추가하고 실온에서 10분 동안 배양하여 반응을 담금질합니다. 세포를 섭씨 4도에서 10, 000g에서 30초 동안 원심분리합니다. 수퍼네이너트는 완전히 제거합니다.
다음으로, PBS의 1 밀리리터로 다시 일시 중단. 세포를 섭씨 4도에서 10, 000g에서 30초 동안 원심분리하고 상체를 제거합니다. 0.2 부피 % 프로테아제 억제제와 2 부피 퍼센트 RNase 억제제로 보충 fCLIP 용해 버퍼의 400 마이크로 리터로 다시 중단.
10 분 동안 얼음에 배양하고 초음파 를 사용하여 초음파 처리합니다. 다음으로 염화나트륨 농도를 150밀리알로 조정하고, 소용돌이를 짧게 조절하기 위해 염화나트륨 5음류 11마이크로리터를 첨가한다. 그런 다음 15 분 동안 섭씨 4도에서 21, 130 g의 원심분리기.
초나타제를 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮춥니다. 면역 침전을 수행하기 위해 먼저 단백질 A 비드 20 마이크로 리터를 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브에 추가하십시오. 그런 다음, 400 마이크로 리터의 fCLIP 리시스 버퍼로 구슬을 씻는다.
1분 동안 섭씨 4도에서 1, 000g의 구슬을 원심분리합니다. 다음으로, 상체를 제거하고, 400 마이크로리터의 fCLIP 리시스 버퍼를 신중하게 추가하고, 3~4회 반전하여 구슬을 부드럽게 재보냅니다. 세면단계를 세 번 반복합니다.
마지막 세척 후, 슈퍼 네이넌트는 완전히 제거합니다. 구슬을 fCLIP 리시스 버퍼300 마이크로리터로 재연합니다. 염화나트륨 농도를 150밀리알로 조정하기 위해 염화나트륨 5마리의 마이크로리터 8.3마이크로리터를 첨가합니다.
단백질 키나아제 RNA 활성화 항체의 10 마이크로리터를 추가하고, 3시간 동안 섭씨 4도에서 회전자에 배양한다. 다음으로, 1분 동안 섭씨 4도에서 1, 000g의 구슬을 원심분리합니다. 상체를 제거하고, 400 마이크로리터의 fCLIP 세척 버퍼를 추가하고, 3~4회 반전하여 구슬을 부드럽게 재보페킹합니다.
워시 스텝을 두 번 반복합니다. 마지막 세척 후, 슈퍼 네이넌트는 완전히 제거합니다. 다음으로 300마이크로리터의 용액을 추가하고 회전자에 섭씨 4도에서 3시간 동안 배양합니다.
그런 다음 1 분간 섭씨 4도에서 1, 000g의 구슬을 원심분리합니다. 상체를 제거하고, 400 마이크로리터의 fCLIP 세척 버퍼를 추가하고, 3~4회 반전하여 구슬을 부드럽게 재보페킹합니다. 세면단계를 세 번 반복합니다.
마지막 세척 후, 상체를 완전히 제거합니다. 다음으로 fCLIP 용출 버퍼 300 마이크로리터를 추가합니다. 25도의 ThermoMixer에서 3시간 동안 온도25도의 인큐베이션을 사용하여 구슬에서 활성을 사용하는 단백질 키나제 RNA를 엘ute합니다.
상온에서 1, 000g의 원심분리기와 수퍼네이츠를 깨끗한 실리콘 튜브로 옮긴다. 마지막으로, 300 마이크로리터의 Proteinase K를 추가하고 섭씨 65도에서 하룻밤 동안 배양합니다. S 또는 M 상에서 HeLa 세포의 세포 주기 체포의 효율은 FACS를 사용하여 검토되었다.
D7F7 항체는 면역 침전 단백질 키나아제 RNA 활성화에 우수한 능력을 보였다. PKR 면역 침전 또는 총 HeLa lysate의 서양 얼룩 분석은 PKR의 크기에 대응하는 단 하나의 강한 밴드를 보여주었으며, 이는 D7F7 항체가 PKR을 인식하는 데 매우 특이적임을 나타낸다. 다른 면역 강수 효율을 가진 다른 PKR 항체를 사용하여, 지도 시퀀싱 읽기의 상이한 클래스 분포귀착됩니다.
PKR 공동 면역 침전RNase에 대한 방사성 동위원소 신호의 감소는 성공적인 rRNA 제거 시 관찰되었다. PKR 공동 면역 침전 RNA 샘플은 부정적인 대조군과 비교하여 미토콘드리아 RNase의 강한 농축을 보였다. 가닥 특이적 역전사는 S 또는 M상 체포 세포를 위해 PKR과 공동 면역침전된 중경량 가닥 미토콘드리아 RNase를 구별하기 위해 사용되었다.
세포 주기 체포 견본을 준비하는 에서 가장 중요한 단계는 PBS로 세포를 두 번 세척해야 하고 균질성을 위해 세포 파스텔만 수집해야 하거나 샘플이 손상될 것입니다. 윤리적으로 공정을 위해 가장 중요한 단계는 포름알데히드 교차 연결 및 수량입니다. 이 절차 후 에로테드 된 RNA는 북부 블로팅, qRT PCR 또는 높은 처리량 시퀀싱을 사용하여 분석 될 수 있습니다.
이러한 실험은 PKR에 바인딩된 RNase의 유형 및 상대적 양을 식별할 수 있습니다. 이 기술은 RNA 결합 단백질에 의해 중재된 유전자 발현의 포스트 전사 조절에 대한 우리의 이해를 향상시키는 RNA 결합 단백질의 RNA 인터액터를 연구하고 확인하기 위하여 적용될 수 있습니다. 포름알데히드는 위험하므로 고정, 용액 및 초기 세척 버퍼를 신중하게 처리해야합니다.
