Este protocolo fornece um método para identificar os interagedores de RNA de uma proteína de ligação de RNA PKR de forma genoma. Isso nos ajuda a entender melhor a regulação pós-transcricional da expressão genética pela proteína de ligação de RNA. A principal vantagem desta técnica é que ela utiliza uma ligação cruzada eficiente de formaldeído para corrigir rnase vinculado a proteínas de ligação de RNA e enriquecê-las através da imunoprecipitação.
PKR ativado é observado em pacientes com doença neurodegenerativa, como Parkinson e Doença de Alzheimer. Identificar RNase de dupla-encalha interagindo com PKR nos ajudará a entender melhor a patogênese dessas doenças degenerativas. Este método pode ser usado para estudar os interagedores de RNA de quaisquer proteínas de ligação de RNA.
Em particular, acreditamos que este método é útil para estudar proteínas que reconhecem o RNase estruturado, como rnase de duplar. Verifique a homogeneidade da amostra de ciclo preso antes de colher células. Além disso, é fundamental otimizar a eficiência da imunoprecipitação usando o melhor anticorpo disponível.
Para começar, sementes 750.000 ou um milhão de células HeLa para amostras de S ou M-phase presos, respectivamente. Cultivar células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Trate as células com timmidina de dois milimônios e incubar a 37 graus Celsius por 18 horas.
Lave as células duas vezes com PBS. Em seguida, adicione mídia fresca, e incubar a 37 graus Celsius por nove horas. Para células presas em fase S, trate células com timmidina de dois mililitros.
Para células presas em fase M, trate células com 100 nanogramas por mililitro de nocodazol. Incubar a 37 graus Celsius por 15 horas. Para uma amostra de fase S, colete células com um raspador de células e transfira para um tubo cônico de 15 mililitros.
Para uma amostra de fase M, toque na lateral do prato de cultura celular para desapegar células presas em fase M, e transfira-as para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, centrifugar as células a 380 g à temperatura ambiente por três minutos. Remova o supernatante e resuspense as células com um mililitro de PBS frio.
Transfira células para tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugar as células a 10.000 g a quatro graus Celsius por 30 segundos, e remover completamente os supernantes. Para realizar o crosslinking de formaldeído, primeiro adicione 750 microliters de 0,1% paraformaldeído às células, e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos para fixar as células.
Em seguida, adicione 250 microliters de glicina de um molar e incubar à temperatura ambiente por mais 10 minutos para saciar a reação. Centrifugar as células a 10.000 g a 4 graus Celsius por 30 segundos. Remova completamente os supernantes.
Em seguida, resuspend com um mililitro de PBS. Centrifugar as células a 10.000 g a quatro graus Celsius por 30 segundos, e remover o supernante. Resuspend com 400 microliters de tampão de lise fCLIP suplementado com 0,2% de volume por cento inibidor de protease e 2% de inibidor de RNase de volume.
Incubar no gelo por 10 minutos, e sonicar usando um ultrassônico. Em seguida, adicione 11 microliters de cloreto de sódio de cinco molares para ajustar a concentração de cloreto de sódio a 150 mililitros, e vórtice brevemente. Em seguida, centrífuga a 21,130 g a 4 graus Celsius por 15 minutos.
Transfira os supernantes para um tubo de microcentrífuga pré-refrigerado de 1,5 mililitro. Para realizar a imunoprecipitação, adicione primeiro 20 microlitadores de proteína A em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, lave as contas com 400 microliters de tampão de lise fCLIP.
Centrifugar as contas a 1.000 g a quatro graus Celsius por um minuto. Em seguida, remova o supernascer, adicione 400 microliters de tampão de lise fCLIP cuidadosamente, e reaprondo suavemente as contas invertendo de três a quatro vezes. Repita o passo de lavagem três vezes.
Após a lavagem final, remova completamente os supernantes. Resuspenja as contas em 300 microliters de tampão de lise fCLIP. Adicione 8,3 microliters de cloreto de sódio de cinco molares para ajustar a concentração de cloreto de sódio a 150 mililitros.
Adicione 10 microliters de proteínas quinas RNA, e incuba em uma rotadora a quatro graus Celsius por três horas. Em seguida, centrifugar as contas a 1.000 g a quatro graus Celsius por um minuto. Remova o supernascer, adicione 400 microliters de tampão de lavagem fCLIP e resuspenque suavemente as contas invertendo de três a quatro vezes.
Repita o passo de lavagem duas vezes. Após a lavagem final, remova completamente os supernantes. Em seguida, adicione 300 microliters de lise e incubar a quatro graus Celsius em um rotador por três horas.
Em seguida, centrifugar as contas a 1.000 g a quatro graus Celsius por um minuto. Remova o supernascer, adicione 400 microliters de tampão de lavagem fCLIP e resuspenque suavemente as contas invertendo de três a quatro vezes. Repita o passo de lavagem três vezes.
Após a lavagem final, remova completamente o sobrenante. Em seguida, adicione 300 microliters de tampão de eluição fCLIP. Incubar em um ThermoMixer a 25 graus Celsius por três horas para a proteína elute quinasase RNA ativado a partir das contas.
Centrifugar a 1.000 g à temperatura ambiente, e transferir os supernantes para um tubo limpo siliconado. Finalmente, adicione 300 microliters de Proteinase K e incubar durante a noite a 65 graus Celsius. A eficiência da detenção do ciclo celular das células HeLa na fase S ou M foi examinada utilizando FACS.
O anticorpo D7F7 mostrou uma capacidade superior de imuno precipitar proteína quinase RNA ativado. A análise de manchas ocidentais do imuno PKR precipitado ou total heLa lysate mostrou apenas uma banda forte correspondente ao tamanho do PKR, indicando que o anticorpo D7F7 é altamente específico no reconhecimento de PKR. O uso de diferentes anticorpos PKR com diferentes eficiências de precipitação imuno, resultou em uma distribuição de classe diferente de leituras de sequenciamento de mapas.
A diminuição do sinal de radioisótopos para RNase co-imunoprecipitado PKR foi observada após a remoção bem sucedida do rRNA. PKR co-imunoprecipitado amostra de RNA, mostrou forte enriquecimento de RNase mitocondrial em comparação com os controles negativos. A transcrição reversa específica da strand foi usada para distinguir o fio pesado e leve mitocondrial RNase que foram co-imunoprecipitados com PKR para células presas fase S ou M.
O passo mais crítico na preparação da amostra de parada do ciclo celular é onde você deve lavar as células duas vezes com PBS e onde você deve coletar apenas células pastel para homogeneidade ou seria prejudicada amostra. Para o processo ético, as etapas mais críticas são o cruzamento de formaldeído e quantidade. Após este procedimento, as RNAs elucidadas podem ser analisadas utilizando-se de manchas do norte, PCR qRT ou sequenciamento de alto rendimento.
Esses experimentos podem identificar o tipo e a quantidade relativa de RNase vinculado ao PKR. Essa técnica pode ser aplicada para estudar e identificar os interagedores de RNA de proteínas de ligação de RNA que melhorarão nossa compreensão da regulação pós-transcricional da expressão genética, mediada por proteínas de ligação de RNA. O formaldeído é perigoso, por isso a fixação, a solução e o buffer de lavagem inicial precisam ser tratados com cautela.
