Bu protokol, rna bağlayıcı protein PKR'nin RNA interaktörlerini genom çapında bir şekilde tanımlamak için bir yöntem sağlar. RNA bağlayıcı protein tarafından gen ekspresyonunun transkripsiyon sonrası düzenlenmesini daha iyi anlamamıza yardımcı olur. Bu tekniğin en büyük avantajı, RNA bağlayıcı proteinlere bağlı RNase'yi onarmak ve immünopresipitasyon yoluyla zenginleştirmek için formaldehitin verimli çapraz bağlanmasını kullanmastır.
Parkinson ve Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalığı olan hastalarda aktive PKR gözlenir. PKR-etkileşen çift iplikçikli RNase'nin tanımlanması bu dejeneratif hastalıkların patogenezini daha iyi anlamamıza yardımcı olacaktır. Bu yöntem, herhangi bir RNA bağlayıcı proteinlerin RNA interactors çalışma için kullanılabilir.
Özellikle, bu yöntemin yapılandırılmış RNase tanıyan proteinleri incelemek için yararlı olduğuna inanıyoruz, örneğin çift iplikli RNase gibi. Hücreleri toplamadan önce döngüden tutuklanan numunenin homojenliğini kontrol edin. Buna ek olarak, mevcut en iyi antikor kullanarak immünopresid verimliliğini optimize etmek için önemlidir.
Başlangıç olarak, sırasıyla S-veya M fazı tutuklanan numuneler için 750, 000 veya bir milyon HeLa hücresi tohum. Hücreleri 37 derecede ve %5 karbondioksitle 24 saat boyunca büyütün. Hücreleri iki milimolar timidin ile tedavi edin ve 18 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Sonra, taze medya ekleyin ve dokuz saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçka. S-faz-arrested hücreleri için, iki milimolar timinin ile hücreleri tedavi.
M-faz-arrested hücreleri için, nocodazol mililitre başına 100 nanogram ile hücreleri tedavi. 15 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Bir S-faz örneği için, bir hücre kazıyıcı ile hücreleri toplamak ve 15 mililitrelik konik tüp içine aktarın.
M fazlı bir örnek için, M fazı tutuklanan hücreleri ayırmak ve bunları 15 mililitrelik konik tüpe aktarmak için hücre kültür çanağının yan tarafına dokunun. Daha sonra, üç dakika oda sıcaklığında 380 g hücreleri santrifüj. Supernatant çıkarın ve soğuk PBS bir mililitre ile hücreleri yeniden askıya.
Hücreleri 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri 10, 000 g'da 4 santigrat derecede 30 saniye santrifüj edin ve süpernatantları tamamen çıkarın. Formaldehit crosslinking gerçekleştirmek için, ilk hücrelere% 0.1 paraformaldehit 750 mikrolitre ekleyin ve hücreleri düzeltmek için 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
Daha sonra, tek azılı glisin 250 mikrolitre ekleyin ve reaksiyonu bastırmak için ek bir 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka. Hücreleri 10,000 g'da 4 derece santigrat derecede 30 saniye santrifüj edin. Supernatants'ı tamamen çıkarın.
Sonra, bir mililitre PBS ile askıya alın. Hücreleri 10,000 g'de 4 santigrat derecede 30 saniye santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. FCLIP lysis tampon 400 mikrolitre ile resuspend 0.2 hacimli proteaz inhibitörü ve iki hacimli RNase inhibitörü ile desteklenir.
10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka ve ultrasonicator kullanarak sonicate. Daha sonra, sodyum klorür konsantrasyonu ayarlamak için beş molar sodyum klorür 11 mikrolitre ekleyin 150 milimolar, ve girdap kısaca. Sonra, santrifüj 21, 130 g dört derece santigrat 15 dakika.
Supernatants önceden soğutulmuş 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp aktarın. İmmünopits gerçekleştirmek için, ilk 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine protein A boncuk 20 mikrolitre ekleyin. Daha sonra boncukları 400 mikrolitre fCLIP lysis tamponu ile yıkayın.
Boncukları 1,000 g'de 4 santigrat derecede bir dakika santrifüj edin. Daha sonra, supernatant çıkarın, fCLIP lysis tampon 400 mikrolitre ekleyin ve yavaşça üç ila dört kez ters çevirerek boncuk ları yeniden askıya. Yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
Son yıkamadan sonra, supernatants tamamen çıkarın. FCLIP lysis tampon 300 mikrolitre boncuk resuspend. Sodyum klorür konsantrasyonu 150 milimolar ayarlamak için beş molar sodyum klorür 8.3 mikrolitre ekleyin.
Protein kinaz RNA-aktive antikor 10 mikrolitre ekleyin ve üç saat boyunca dört derece santigrat bir rotator üzerinde kuluçka. Sonra, boncukları 1,000 g'de 4 santigrat derecede bir dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın, fCLIP yıkama tampon 400 mikrolitre ekleyin ve yavaşça üç ila dört kez ters çevirerek boncuk ları yeniden askıya.
Yıkama adımını iki kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, supernatants tamamen çıkarın. Daha sonra, 300 mikrolitre lysate ekleyin ve üç saat boyunca bir rotator üzerinde dört santigrat derecede kuluçka.
Sonra, boncukları 1,000 g'de 4 santigrat derecede bir dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın, fCLIP yıkama tampon 400 mikrolitre ekleyin ve yavaşça üç ila dört kez ters çevirerek boncuk ları yeniden askıya. Yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
Son yıkamadan sonra, supernatant tamamen çıkarın. Ardından, 300 mikrolitre fCLIP elüsyon arabelleği ekleyin. Boncuklardan aktive protein kinaz RNA'yı eleştirmek için 25 derecede 25 santigrat derecede kuluçkaya yatın.
Oda sıcaklığında 1,000 g'da santrifüj edin ve süpernatantları temiz silikonlu bir tüpe aktarın. Son olarak, Proteinaz K 300 mikrolitre ekleyin ve 65 santigrat derece gecede kuluçka. S veya M fazındaki HeLa hücrelerinin hücre döngüsü ndeki arrestinin etkinliği FACS kullanılarak incelendi.
D7F7 antikor immün çökelti protein kinaz RNA aktive üstün bir yetenek gösterdi. PKR immünopresör veya total HeLa lysate batı leke analizi PKR büyüklüğüne karşılık gelen sadece bir güçlü bant gösterdi, D7F7 antikor PKR tanımada son derece spesifik olduğunu gösteren. Farklı immün çökeltme verimliliği ile farklı PKR antikorları kullanarak, harita sıralama okuma farklı bir sınıf dağılımı ile sonuçlandı.
Başarılı rRNA çıkarılması sırasında PKR co-immünoppititated RNase için radyoizotop sinyalinde azalma gözlendi. PKR co-immünopprepititated RNA örneği, negatif kontrollere göre mitokondriyal RNase güçlü zenginleştirme gösterdi. İplik spesifik ters transkripsiyon, S veya M fazı tutuklanan hücreler için PKR ile birlikte immünoppresipitated olan ağır ve hafif iplikçik mitokondriyal RNase ayırt etmek için kullanılmıştır.
Hücre döngüsü tutuklama örneğinin hazırlanmasında en kritik adım, hücreleri PBS ile iki kez yıkamanız gereken ve homojenlik için sadece hücre pastel toplamanız gereken veya numunenin bozulduğu yerdir. Etik süreç için, en kritik adımlar formaldehit crosslinking ve miktar vardır. Bu işlemden sonra eluted RNA'lar kuzey blotlama, qRT PCR veya yüksek iş elde ekincing kullanılarak analiz edilebilir.
Bu denemeler, PKR'ye bağlı RNase'nin türünü ve göreli miktarını belirleyebilir. Bu teknik, RNA bağlayıcı proteinlerin transkripsiyonel regülasyonu hakkındaki anlayışımızı geliştirecek olan RNA bağlayıcı proteinlerin RNA interaktörlerini incelemek ve tanımlamak için uygulanabilir. Formaldehit tehlikelidir, bu nedenle fiksasyon, çözelti ve ilk yıkama tamponunun dikkatli bir şekilde ele alınması gerekir.
