פרוטוקול זה מספק שיטה לזיהוי אינטראקציות RNA של PKR חלבון מחייב RNA באופן גנום רחב. זה עוזר לנו להבין טוב יותר את הרגולציה שלאחר שעתוק של ביטוי גנים על ידי חלבון מחייב RNA. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מנצלת crosslinking יעיל של פורמלדהיד כדי לתקן RNase קשור חלבונים מחייב RNA ולהעשיר אותם באמצעות immunoprecipitation.
PKR פעיל נצפתה בחולים עם מחלה ניוונית, כגון פרקינסון ואלצהיימר. זיהוי PKR-אינטראקציה כפולה תקוע RNase יעזור לנו להבין טוב יותר את הפתוגנזה של מחלות ניווניות אלה. שיטה זו יכולה לשמש לחקר אינטראקציות RNA של כל חלבונים מחייבי RNA.
בפרט, אנו מאמינים כי שיטה זו שימושית ללמוד חלבונים המזהים את RNase מובנה, כגון RNase כפול תקוע. בדוק את ההומוגניות של המדגם שנעצר במחזור לפני קצירת תאים. בנוסף, חיוני לייעל את יעילות immunoprecipitation באמצעות הנוגדן הטוב ביותר הזמין.
כדי להתחיל, זרע 750, 000 או מיליון תאי HeLa עבור דגימות S-או M-פאזה נעצר, בהתאמה. לגדל תאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות. לטפל בתאים עם תימידין שני מילימולרים, ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות.
לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. לאחר מכן, מוסיפים מדיה טרייה, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך תשע שעות. עבור תאים שנעצרו בשלב S, לטפל בתאים עם תימידין שני מילימולר.
עבור תאים שנעצרו M-פאזה, לטפל בתאים עם 100 ננוגרם למיליליטר של nocodazole. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 שעות. לקבלת דגימת S-phase, לאסוף תאים עם מגרד תאים, ולהעביר לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר.
לקבלת דגימת M-phase, הקש על הצד של צלחת תרבות התאים כדי לנתק תאים שנעצרו על-ידי M-phase, והעבר אותם לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה התאים ב 380 גרם בטמפרטורת החדר במשך שלוש דקות. הסר את על-טבעי, ו resuspend התאים עם מיליליטר אחד של PBS קר.
מעבירים תאים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה התאים ב 10, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 שניות, ולהסיר את supernatants לחלוטין. כדי לבצע הצלבה פורמלדהיד, תחילה להוסיף 750 microliters של 0.1% paraformaldehyde לתאים, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כדי לתקן את התאים.
לאחר מכן, מוסיפים 250 מיקרוליטרים של גליצין אחד טוחן ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות נוספות כדי לרוות את התגובה. צנטריפוגה התאים ב 10, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 שניות. הסר את העל-טבעיים לחלוטין.
לאחר מכן, תן שימוש חוזר עם מיליליטר אחד של PBS. צנטריפוגה התאים ב 10, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 שניות, ולהסיר את supernatant. תן מחדש עם 400 microliters של מאגר תזה fCLIP בתוספת 0.2 נפח אחוז מעכב פרוטאז ושני אחוז נפח מעכב RNase.
דגירה על קרח במשך 10 דקות, ו sonicate באמצעות ultrasonicator. לאחר מכן, להוסיף 11 microliters של חמישה כלוריד נתרן טוחן כדי להתאים את ריכוז נתרן כלורי ל 150 מילימולר, ומערבולת לזמן קצר. ואז, צנטריפוגה ב 21, 130 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
מעבירים את העל-טבעיים לצינור מיקרוצנטריפוגה מקורר מראש של 1.5 מיליליטר. כדי לבצע immunoprecipitation, תחילה להוסיף 20 microliters של חלבון A חרוזים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, לשטוף את חרוזים עם 400 microliters של מאגר תזה fCLIP.
צנטריפוגה את חרוזים ב 1, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת. לאחר מכן, הסר את העל-טבעי, הוסף 400 מיקרוליטרים של מאגר תיזה fCLIP בזהירות, ולחץ בעדינות על חרוזים על-ידי היפוך שלוש עד ארבע פעמים. חזור על שלב הכביסה שלוש פעמים.
לאחר הכביסה הסופית, להסיר את supernatants לחלוטין. התן מחדש את חרוזים ב 300 microliters של מאגר תזה fCLIP. הוסף 8.3 microliters של חמישה כלוריד נתרן טוחן כדי להתאים את ריכוז נתרן כלורי ל 150 מילימולר.
מוסיפים 10 מיקרוליטרים של נוגדן המופעל על ידי RNA של חלבון קינאז, ודורגים על מסובב בארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות. לאחר מכן, צנטריפוגה את חרוזים ב 1, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת. הסר את העל-טבעי, הוסף 400 מיקרוליטרים של מאגר שטיפת fCLIP, ולחץ בעדינות על חרוזים על-ידי היפוך שלוש עד ארבע פעמים.
חזור על שלב הכביסה פעמיים. לאחר הכביסה הסופית, להסיר את supernatants לחלוטין. לאחר מכן, מוסיפים 300 מיקרוליטרים של ליט, ו דגירה בארבע מעלות צלזיוס על מסובב במשך שלוש שעות.
לאחר מכן, צנטריפוגה את חרוזים ב 1, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת. הסר את העל-טבעי, הוסף 400 מיקרוליטרים של מאגר שטיפת fCLIP, ולחץ בעדינות על חרוזים על-ידי היפוך שלוש עד ארבע פעמים. חזור על שלב הכביסה שלוש פעמים.
לאחר הכביסה הסופית, להסיר את העל טבעי לחלוטין. לאחר מכן, הוסף 300 מיקרוליטרים של מאגר אלוט fCLIP. דגירה ב ThermoMixer ב 25 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות כדי לשאוב חלבון קינאז RNA מופעל מן חרוזים.
צנטריפוגה ב 1, 000 גרם בטמפרטורת החדר, ולהעביר את supernatants לצינור סיליקון נקי. לבסוף, מוסיפים 300 מיקרוליטרים של Proteinase K ו דגירה לילה ב 65 מעלות צלזיוס. היעילות של מעצר מחזור התא של תאי HeLa בשלב S או M נבדקו באמצעות FACS.
נוגדן D7F7 הראה יכולת מעולה לזרז RNA קינאז חלבון מופעל. ניתוח כתם מערבי של אימונו PKR זירז או סך HeLa lysate הראה רק רצועה חזקה אחת המתאימה לגודל של PKR, המציין כי הנוגדן D7F7 הוא ספציפי מאוד בזיהוי PKR. שימוש בנוגדני PKR שונים עם יעילות משקעים חיסונית שונה, הביא להתפלגות מעמדית שונה של קריאות רצף מפות.
ירידה באות radioisotope עבור PKR שיתוף immunoprecipitated RNase נצפתה על הסרת rRNA מוצלחת. PKR שיתוף immunoprecipitated מדגם RNA, הראה העשרה חזקה של RNase המיטוכונדריאלי לעומת הפקדים השליליים. שעתוק הפוך ספציפי סטרנד שימש כדי להבחין RNase מיטוכונדריאלי גדיל כבד וקל שהיו יחד עם PKR עבור תאים שנעצרו שלב S או M.
השלב הקריטי ביותר בהכנת מדגם מעצר מחזור התא הם שבו אתה חייב לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ואיפה אתה חייב לאסוף רק תאים פסטל עבור הומוגניות או יהיה מדגם לקוי. עבור תהליך אתי, הצעדים הקריטיים ביותר הם הצלבה פורמלדהיד וכמות. לאחר הליך זה ניתן לנתח את RNAs eluted באמצעות כתמים בצפון, PCR qRT או רצף תפוקה גבוהה.
ניסויים אלה יכולים לזהות את הסוג ואת הכמות היחסית של RNase מאוגד PKR. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד ולזהות אינטראקציות RNA של חלבונים מחייבים RNA אשר ישפרו את ההבנה שלנו של ויסות שלאחר שעתוק של ביטוי גנים, מתווך על ידי חלבונים מחייבים RNA. פורמלדהיד מסוכן ולכן יש לטפל בזהירות בהקבעה, בפתרון ובאגר הכביסה הראשוני.
