La plataforma vectorial Lentiviral tiene una gran ventaja sobre la plataforma vectorial más popular, específicamente debido a la capacidad de los vectores lentivirales para acomodar un inserto genético más grande. Por lo tanto, parece que el vector lentiviral sería la plataforma de elección en la aplicación implica la entrega de herramientas CRISPR/Cas. Esta técnica imita el mecanismo regulador natural de la expresión de alfa-sinucleína que cuando se deteriora se asocia con la enfermedad.
Permite ajustar el nivel de expresión frente a cambios robustos en la expresión génica. Recomiendo encarecidamente validar este o enfoques similares utilizando múltiples ARN guía para la detección. Hay una gran variabilidad en la potencia del ARN guía.
La única manera de determinarlo es que hay un cribado y validación robustos y completos. El sistema desarrollado se puede adaptar fácilmente a otros sistemas modelo, como modelos animales, incluidos roedores y primates no humanos. Estos experimentos de seguimiento podrían servir como una prueba de concepto para futuros estudios clínicos.
Demostrando el procedimiento estará la Dra. Ekaterina Ilich, miembro del personal superior de mi laboratorio, centrada en la ejecución del procedimiento de clonación molecular para la creación de Plásmidos Vectoriales Lentivirales relacionados con este proyecto. También demostrará los pasos clave involucrados en la producción de Vectores Lentivirales. También demostrará el procedimiento la Dra. Lidia Tagliafierro, un postdoctorado de mi laboratorio que se centra en la diferenciación de las células iPS humanas en células patológicas relevantes.
Demostrará los pasos clave en el establecimiento de ensayos para evaluar los perfiles de metilación de la sinucleína intron1. Ahila Sriskanda, un miembro del personal de mi laboratorio que se centra en el cultivo de células progenitoras derivadas de células iPS humanas. Para comenzar, desarrolle el dominio catalítico DNMT3A a partir del d-Cas9-DNMT3A-GFP amplificando la porción DNMT3A del vector.
Después de digerir el fragmento DNMT3A usando una enzima de restricción BamH1. Cloat en el sitio BamH1 del vector modificado PBK-301 que transporta d-Cas9 y verificado por secuenciación directa de Sanger, para reemplazar el gen reportero Meissen puro y el plásmido resultante con GFP digest d-Cas9-DNMT3A-P2A pure Meissen y plásmido con FSC 1. Purificar el fragmento vectorial utilizando un método de purificación de gel.
Prepare la plaquita digiriendo PBK-201 con FSC-1. Clonar el fragmento FSC 1 en el vector para crear d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP. Recubrir las placas de 15 centímetros con 0,2% de gelatina para la transfección y esperar 10 minutos.
A continuación, aspirar la gelatina y añadir 22,5 mililitros de alto medio de glucosa y 2,5 mililitros de suspensión celular HEK-293T previamente cultivada. Incubar las placas a 37 grados centígrados con un 5% de CO2 hasta alcanzar entre el 70 y el 80% de confluencia. Para preparar la mezcla de plásmido suficiente para la placa de 115 centímetros utilice los cuatro plásmidos descritos en el manuscrito.
Añadir 312,5 micro litros de un cloruro de calcio molar al mismo tubo de 15 mililitros con los plásmidos y llevar el volumen final a 1,25 mililitros utilizando agua estéril doble destilada. añadir suavemente 1,25 mililitros de dos solución X BBM gota sabia al tubo durante el vórtice. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Aspirar el medio de las células y añadir 22,5 mililitros de DMEM de glucosa alta recién preparada sin suero. Añadir 2,5 mililitros de la mezcla de transfección gota sabia a cada plato. Revolotea las placas e incubar a 37 grados celsius con 5%CO2 durante dos a tres horas después de la incubación añadir 2,5 mililitros de suero por placa para lograr un 10% de dilución e incubar durante la noche a 37 grados Celsius con 5%CO2.
Para cosechar el virus recoger el sobrenadante de todas las células trans infectadas y tirar de ellos en tubos cónicos de 50 mililitros. Centrifugar a 400 a 450 g durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego filtrar el sobrenadante a través de la unidad de filtro de vacío de 0,45 micrómetros. A continuación, cree un gradiente de sacarosa mediante la preparación de tubos cónicos de centrifugación ultra.
Agregue cuidadosamente el sobrenadante filtrado al gradiente distribuyendo por igual el sobrenadante viral entre cada tubo de centrifugación ultra llenando al menos tres cuartas partes de cada tubo. Centrifugar las muestras a 70000 g durante dos horas a 17 grados centígrados. Recoger suavemente 30%a 60%fracciones de sacarosa en tubos limpios añadir frío 1X PBS hasta 100 mililitros de volumen total y pipeta varias veces para mezclar.
Añadir cuidadosamente cuatro mililitros de 20% de sacarosa en 1X PBS a cada tubo para estratificar la preparación viral continúe pipeteando aproximadamente 20 a 25 mililitros de la solución viral por cada tubo. Equilibre cuidadosamente los tubos y luego centrifugar a 70000 g durante dos horas a 17 grados centígrados. Aspirar cuidadosamente el líquido restante para eliminar por completo todo el líquido dejando el virus que contiene pellets que apenas son visibles como pequeñas manchas translúcidas.
Después de vaciar el sobrenadante invertir los tubos en toallas de papel para permitir que el líquido restante drene. Añadir 70 micro litros de 1X PBS al primer tubo y pipetear a fondo para volver a suspender el pellet. Transfiera la suspensión al siguiente tubo y repita con pipeteo y transferencia hasta que todos los pellets se vuelvan a suspender.
Agregue 50 micro litros adicionales de 1X PBS al primer tubo y mezcle para lavarlo. A continuación, transfiera la suspensión al segundo tubo para lavarla y continuar con el lavado y la transferencia como anteriormente, produciendo aproximadamente 120 micro litros de la suspensión final ligeramente lechosa. Centrifugar a 10000 g durante 60 segundos para obtener una suspensión clara transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y haga alícuota de cinco micro litros y guárdelas a 80 grados Celsius negativos coloque un Cryovial con MD NPC en un bloque de calor de 37 grados Celsius durante dos minutos y transfiera las células descongeladas a un tubo cónico de 15 mililitros con 10 mililitros de DMEM-F12 caliente.
Centrifugar a 300 g durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en dos mililitros de medio N2B2 completo precalentado. Añadir dos mililitros de N2B27 a la suspensión celular y placa dos mililitros de células en cada pozo de la placa de seis pozos previamente preparada codificada BMM.
Incubar las células a 37 grados centígrados con un 5%de CO2 durante la noche. Cuando los PNJ MD están al 70%confluencia, transducirlos añadiendo dos micro litros de vectores de ARN d-Cas9-DNMT3A de la guía lentivirus y arremolinar suavemente la placa. Después de incubar las células en las mismas condiciones que anteriormente durante 16 horas reemplace el medio N2B27 48 horas después de la transducción.
Añadir N2B27 con cinco microgramos por mililitro de Meissen puro para obtener las líneas estables DE NPC MD, crecer las células durante tres semanas en N2B27 más Meissen puro para caracterizar el perfil de metilación de SNCA intron 1. Primero extraiga ADN de cada línea celular de transductor estable usando un kit de extracción de ADN, luego use 800 nanogramos de ADN para realizar una conversión de bisulfuro con un kit disponible comercialmente y luego un ADN convertido bisulfido a 20 nanogramos por micro litro. Para el análisis de pirosecuenciación preparar la mezcla maestra de PCR en un tubo libre de núcleos transferir la placa de reacción a un termociclo e iniciar la PCR.
Visualice los amplicons utilizando dos micro litros de producto PCR con una tinción de 30 y bromuro después de la electroforesis de gel de Agarose. Para los ensayos de secuenciación pirofcionante se utilizaron mezclas de DNA sin metilarse y metilados por sulfuro convertidos y reactivos de secuenciación pirotractora como se describe en el manuscrito. Calcular los valores de metilación para cada sitio CPG utilizando rendimientos físicos de software de secuenciación de pir pirocisión del vector Lentivirus d-Cas9-DMMT3A-GFP y el vector naive GFP generado con este protocolo son comparables.
Esto sugiere que la utilidad de la columna vertebral vectorial optimizada combinada con el protocolo de producción optimizado da como resultado un alto rendimiento más estricto de las tasas de transducción de vectores CRISPR-dCas9 del vector Lentivirus d-Cas9-DNMT3 GFP fue cuatro veces menor que la del vector naive GFP, lo que sugiere que se reduce la eficiencia de empaquetado del vector CRISPR d-Cas9-RNA. Las tasas de transducción del vector Naive PURO fueron cinco veces más altas en comparación con el vector d-Cas9-DNMT3A. Estos resultados se confirmaron aún más utilizando el GFP ingenuo y el d-Cas9-DNMT3A-GFP.
El protocolo basado en EB descrito aquí permite la diferenciación de LOS NPC MD. hiPSCs expresaron el marcador de potencia de placer Oct4 mientras que el NPC MD se expresa tanto Nestin como FoxA2. Se diseñaron y validaron siete ensayos de pirosecuenciación para la cuantificación del estado de metilación en el intrón 1 de la SNCA.
Los 7 ensayos fueron validados y mostraron correlación lineal, utilizando los ensayos validados fue posible determinar los niveles de metilación en los 23 CPG en el intrón 1 de la SNCA Lo más importante a recordar que asistir a este procedimiento es trabajar con células que muestran el crecimiento y la salud adecuados para asegurar la coherencia en todos los experimentos. La producción de vectores de lentejas resaltados en esta presentación se puede adoptar fácilmente para la producción de integrales deficientes anti-virus que también se puede escalar fácilmente para generar grandes cantidades o vectores más concentrados. Esta técnica puede allanar el camino para explorar el impacto patógeno de la desregulación de genes en la edad relacionada ni los trastornos generativos, incluyendo la enfermedad de Alzheimer y las demencias relacionadas.
La ventaja de los vectores de lentejas que se desarrollan aquí es que no es peligro o no los vectores de lentejas infecciosas tienen sólo un efecto mínimo en el ciclo celular son una plataforma de administración segura y confiable para aplicaciones de terapia génica.
