Es difícil modular la expresión génica en los islotes humanos, también un mayor declive de los islotes humanos en funcionamiento plantean grandes desafíos después de la modulación de la expresión génica. Mediante la combinación de la transducción SHR8 mediada por lentivirus y la formación de islotes adecuados para humanos. Este protocolo permite una regulación eficiente de un gen objetivo mientras se preserva la función del islote durante el cultivo prolongado.
Para empezar, gire suavemente la botella de envío para mantener los islotes en suspensión. Transfiera el medio de envío que contiene islotes a un tubo de centrífuga cónica de 50 mililitros. Deje que el tubo se siente en un armario de seguridad biológica durante 15 minutos para que los islotes se asienten en la parte inferior del tubo.
Retire suavemente el medio de envío con una pipeta capilar sin alterar el pellet del islote. Vuelva a suspender el pellet de islote en medio CMRL con albúmina sérica 1% humana a una concentración de 400 islotes equivalentes por mililitro. Transfiera los islotes a un plato tratado con cultivo no tisular y escútelos a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono del 5% durante la noche.
Después del cultivo nocturno, transfiera los islotes humanos a un tubo de centrífuga cónica de 15 mililitros, centrífuga a 250 veces g durante cinco minutos en un rotor de cubo oscilante. Y aspirar el medio con una pipeta capilar sin alterar el pellet del islote. Lavar el pellet mi adición de 10 mililitros de PBS al tubo, mezclar suavemente y centrífuga a 250 veces g durante cinco minutos.
Después de la centrifugación, aspirar PBS sin alterar el pellet de islote. Vuelva a suspender el pellet en 0,5 mililitros de una mezcla de enzima proteolítica y colágeno precaliente. Pipeta cinco veces con una pipeta P1000 para mezclar islotes.
Incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de la incubación, mezcle la pipeta acariciando suavemente. Compruebe si hay nubosidad de una sola célula y el número de escamas o islotes no digeridos.
Coloque un colador de 40 micras en una placa de petri de 35 milímetros y moje el colador añadiendo un mililitro de CMRL medio con 10% de suero bovino fetal inactivado con calor y presionando con un émbolo de jeringa de un mililitro. Transfiera toda la suspensión celular en la parte superior del colador. Y recoger el paso a través de un tubo fresco de 15 mililitros.
Lavar el tubo utilizado para la digestión de los islotes con 0,5 mililitros de medio CMRL fresco para recoger las células sobrantes y pasar el lavado a través del colador. Combine el paso en un tubo de 15 mililitros. Repita una vez.
Para disociar los islotes no digeridos que quedan en el colador, presione el colador con un émbolo de jeringa de un mililitro. Recoger el paso a través de nuevo y lavar el colador con CMRL 1066 medio fresco para eliminar todos los islotes digeridos restantes del colador y el plato. Agregue el paso a través del tubo de 15 mililitros.
Registre el volumen total de la suspensión celular y tome una alícuota de 10 microlitrolidores de células para contar el número de célula en un hemocitoómetro. Después de centrifugar la suspensión celular durante cinco minutos a 200 veces g, retire el medio sin alterar el pellet. Para producir pseudo-islotes usando una placa de fijación ultrabajo de 96 pozos, primero calcule el volumen total de la requerida una vez 10 a las quintas células por mililitro de la suspensión de una sola célula.
Luego, vuelva a suspender el pellet de islote en medio CMRL con 10% de suero bovino fetal inactivado con calor térmico para que 30 microlitros de la suspensión celular tenga 3000 células. A continuación, transfiera el volumen requerido de la suspensión de una sola célula a un tubo nuevo de 15 mililitros. A 250 unidades de transducción por célula de un lentivirus que contiene ARN-RNA dirigido a un gen de interés o un control.
Para mezclar la suspensión celular con el virus, pipetee suavemente cinco veces con una pipeta P1000. A continuación, transfiera las células mixtas a un depósito de reactivos estériles de 50 mililitros si utiliza una pipeta de ocho canales. Con una pipeta de ocho canales o una pipeta P200, dispensar 30 microlitros por pozo de la suspensión celular mezclada con lentivirus en cada pozo.
A continuación, centrifugar la placa de 96 pozos en una centrífuga de placa de cubo oscilante a 270 g a temperatura ambiente durante siete minutos. Cultivo a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% durante la noche. Después de la incubación, retire la placa de 96 pozos de la incubadora y colóquela en el armario de seguridad biológica.
Pipetear 100 microlitros por islote de FBSCMRL 10% alto en un pozo para evitar el secado de islotes y continuar el cultivo durante una semana. Pipetear 100 microlitros por pozo de CMRL medio con 10%calor inactivado suero bovino desde el depósito hasta los pseudo-islotes y pipeta arriba y abajo dos a tres veces suavemente en el pozo para levantar los islotes hacia arriba. A continuación, aspirar el medio en el pozo que contiene un pseudo-islote y expulsar en un plato de petri de 10 centímetros.
Compruebe la placa bajo un microscopio de luz para asegurar la eliminación completa de todos los pseudo-islotes y proceder a experimentos aguas abajo. Para producir pseudo-islotes utilizando una placa de cultivo de micro pozo de 24 pozos, primero agregue 500 microlitros por pozo de una solución de enjuague antiadherente. Centrifugar a 1300 g durante cinco minutos en una centrífuga de placa de cubo oscilante.
A continuación, observe la placa bajo un microscopio para asegurarse de que las burbujas de aire se eliminan de los micro-pozos. En un armario de seguridad biológica, aspirar la solución de enjuague antiadherencia de los pozos. Enjuague cada pozo con dos mililitros de medio CMRL 1066 liso y cálido una vez.
A continuación, aspirar el medio CMRL 1066 liso y añadir 0,5 mililitros por pozo de CMRL caliente con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor a cada bien planeado para su uso. Determine el número total de celdas necesarias para cada pozo. Re-suspenda las células individuales en 0,8 mililitros de CMRL medio con 10%suero bovino fetal inactivado por calor en un tubo estéril de 1,5 mililitros.
Para crear un pozo de pseudo-islote transducido por un lentivirus, agregue 125 unidades de transducción por célula a la suspensión de una sola célula manteniendo el volumen de virus por debajo de 0,2 mililitros. Incubar la mezcla celular y de virus a 37 grados centígrados con mezcla suave ocasional durante una hora para permitir el contacto de las células con el virus antes de la condensación de las células. Después de una hora, ajuste el volumen total de la célula de islote y la mezcla de virus a un mililitro añadiendo cm3 medio con 10%suero bovino activado por calor.
Si las células forman grumos después de una incubación de una hora se dispersan en una suspensión de una sola célula por pipeteo suave y rápido de dos a tres veces. Transfiera la suspensión celular a un pozo de la placa de cultivo de micro-pozo de 24 pozos. Inmediatamente después del pipeteo, centrifugar a 100 veces g a temperatura ambiente durante tres minutos para capturar las células en todos los micro-pozos.
Observe bajo un microscopio para verificar que las células se distribuyen uniformemente en todos los micro-pozos. Es fundamental centrifugar la placa de micro-pozo inmediatamente después de agregar el pozo mezclando la suspensión de una sola célula de islote en los pozos. Los cambios secuenciales en la morfología de pseudo-islotes a partir de 3000 células de islotes humanos creadas en una placa de unión ultra baja de 96 pozos mostraron grupos monocapa o sueltos de células convertidas en agregados sólidos con un borde redondo suave en una semana.
Por el contrario, en una placa de cultivo de micro-pozo, la formación de células y pseudo-islotes de sólo 500 células de islotes es generalmente visible dentro de cuatro días. El tamaño uniforme de los pseudo-islotes reduce la variación dentro de un grupo de prueba y permite la incubación estática utilizando tan solo cinco pseudo-islotes por medición. El ensayo Perry Fusion para la respuesta a la insulina mostró que los pseudo-islotes humanos mantuvieron una sólida secreción de insulina en la primera fase en respuesta a la glucosa después de siete días de cultivo.
La introducción de lentivirus dirigido a la lipasa de triglicéridos adiposo humano o a cinco genes en una sola suspensión celular garantiza la transducción eficiente y homogénea de las células de los islotes y logra una regulación descendente altamente eficiente de los genes. Es importante recordar que el tiempo necesario para dispersar el islote humano en células individuales se ve afectado por muchos factores como: tamaño, distribución y la característica del donante. Por lo tanto, es importante prestar mucha atención a la desaparición de los islotes humanos durante la digestión.
A lo largo del protocolo es importante manejar la suspensión de una sola célula suavemente para evitar la pérdida de células. Los pseudo-islotes humanos que se crean se pueden utilizar para muchas aplicaciones para determinar el efecto de la modulación génica como: Western Blot, estudio histológico y las mediciones de las tasas de consumo de oxígeno. Este protocolo permite evaluar la baja del gen objetivo en la regulación de la salud de los islotes y la función en los islotes humanos mediante el uso de material de laboratorio común y técnicas simples.
El uso de islotes humanos puede requerir una aprobación previa de una junta de revisión local. Por favor, consulte a la junta de revisión local antes de iniciar el estudio. Lentivirus se clasifica como nivel de bioseguridad dos.
Póngase en contacto con el comité de bioseguridad antes de iniciar el uso del lentivirus.
