Este método permite la fabricación de ensamblajes plasmónicos quirales tridimensionales con fuertes respuestas quirócticas. La principal ventaja de este enfoque es que permite la fabricación de nanoestructuras metálicas complejas utilizando herramientas de software de libre disponibilidad y equipos comunes de laboratorio de bioquímica. Demostrando el procedimiento será Yike Huang un estudiante de posgrado y Minh-Kha Nguyen un postdoctorado de mi laboratorio.
Utilice caDNAno para diseñar una plantilla de origami de ADN. Enrute el andamio en hebras de grapas de acuerdo con la forma deseada de la plantilla. A continuación, genere las secuencias de hebras de grapas haciendo clic en la herramienta de secuencia.
Haga clic en la herramienta de pintura y marque las hebras de grapas que requieren más modificaciones. Haga clic en la herramienta de exportación para exportar las secuencias de grapas de ADN a un archivo CSV. A continuación, importe el archivo CSV en una aplicación de hoja de cálculo.
Agregue una secuencia de poliadenina al final de las grapas que se utilizarán como asas para el ensamblaje de nanorod de oro. Modifique las hebras de grapas en los sitios de bloqueo diseñados con secuencias de bloqueo. Preparar un stock de trabajo de hebras básicas, incluyendo hebras con asas y cerraduras mezclando cantidades iguales de oligonucleótidos básicos normalizados de concentración.
A continuación, prepare la mezcla de origami como se detalla en el protocolo de texto. Anneal la mezcla en el termociclo de 80 grados a 20 grados Celsius. Para un gel al 1%, disolver un gramo de agarosa en 100 mililitros de TBE calentando la mezcla en el horno microondas.
Agregue 10 microlitros de 10.000X de mancha de ADN de acuerdo con la especificación de la mancha. Para minimizar la exposición a la luz UV en el paso de extracción, utilice una mancha de ADN que se puede visualizar bajo excitación azul. Arroje el gel e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, coloque la caja de gel en un baño de agua helada. Añadir búfer de carga a las muestras de origami y cargar las muestras en los pozos con un volumen adecuado de acuerdo con el cono utilizado. Ejecuta la electroforesis durante dos horas a 80 voltios.
Image el gel con el gel imager. Utilice un transilluminador de luz azul para visualizar las bandas y cortar la banda de origami. A continuación, romper el gel en parafilm y extraer el líquido.
El rendimiento de recuperación es de aproximadamente 40% Pipetear el líquido en una unidad de filtro centrífuga y girar a 3.000 veces G durante cinco minutos. Mida la absorción de la solución de origami a 260 nanómetros con un espectrómetro visible UV. Para preparar las nanorods de oro, disolver 0,55 gramos de CTAB y 0,037 gramos de 2, 6-dihidroxibenzoico ácido en 15 mililitros de agua tibia en un matraz inferior redondo.
Después de enfriar la solución a 30 grados Celsius, añadir 600 microlitros de cuatro nitrato de plata milimétrica y remover a 450 RPM durante dos minutos. Deje la solución sin perturbaciones durante 15 minutos a 30 grados centígrados. A continuación, agregue 15 mililitros de un tetracloroaurato de hidrógeno milimiolar a la solución y revuelva a 450 RPM durante 15 minutos.
Además, añadir 120 microlitros de ácido L-ascórbico de 64 milimolares y agitar inmediatamente a 1,200 RPM durante 30 segundos. Ahora, añade 12 microlitros de semillas de oro y sigue revolviendo a 1.200 RPM durante 30 segundos. Incubar la solución en un baño de agua a 30 grados centígrados durante 18 horas.
No moleste la solución y utilice una tapa para cerrar el matraz. Transfiera la solución resultante a tubos centrífugos y centrífuga a 9.500 veces G durante 12 minutos a 20 grados centígrados. Deseche el sobrenadante y disperse el pellet en 20 mililitros de agua ultra pura.
Realice un paso más de centrifugación y luego disperse el pellet final en tres mililitros de agua destilada. Estimar la concentración de nanorods de oro a partir de una medición de absorción visible UV utilizando el coeficiente de extinción para la resonancia longitudinal del plasmón. Mezclar 150 microlitros de 10 nanorods de oro nanomolar y 40 microlitros de ADN tiol tratado con TCEP de 0,5 milimolar.
Añadir 1%SDS a la solución de nanorod de oro hasta que se alcance una concentración final de SDS de 0.05%. Ajuste el PH a entre 2.5 y tres con aproximadamente un microlitro de un molar HCL. Incubar durante dos horas mientras se agita a 70 RPM.
Añadir cloruro de sodio para alcanzar una concentración final de cloruro de sodio de 0,5 molares e incubar durante cuatro horas a temperatura ambiente mientras se agita a 70 RPM. A continuación, ajuste el PH a aproximadamente 8,5 con tampón TBE 10X e incubar durante la noche. Lave las nanorods de oro DNA cuatro veces mezclando las muestras con un mililitro de tampón de lavado y centrífuga a 7.000 veces G durante 30 minutos.
Retire el sobrenadante y resusppend las nanorods de oro de ADN en el líquido restante. Estimar la concentración de nanorods de oro de ADN a partir de una medición de absorción visible UV como antes. Añadir cloruro de magnesio a la solución de nanorods de oro de ADN purificado a una concentración final de 10 milimolar.
Mezclar los nanorods y origami de oro de ADN purificado a una proporción de 10 a uno y producir la mezcla en un mezclador con un control de temperatura de 40 grados Celsius a 20 grados Celsius mientras agita a 400 RPM. Utilice 0.7%agarose gel electrophoresis para purificar las estructuras finales de nanorod de oro de origami. Para la toma de imágenes TEM, mezcle 200 microlitros de 0,75% de solución de formato de uranilo y 1 microlitro de cinco molares de hidróxido de sodio.
Vórtice inmediatamente durante dos o tres minutos. Centrifugar la solución de tinción durante tres a cuatro minutos a 14.000 veces G.Then, proteja la mancha de la exposición a la luz envolviéndola en papel de aluminio. Después de aumentar la hidrofalicidad de las rejillas TEM como se describe en el protocolo de texto, pipetear cinco microlitros gotas de muestra en la cuadrícula TEM.
Después de una incubación de cinco a ocho minutos, retire la gota tocando suavemente un papel de filtro con el borde de la rejilla. Ahora, pipetear una gota grande y una pequeña gota de la solución de manchas en un pedazo de parafilm. Coloque la rejilla en la pequeña gota de solución de manchas y séquela inmediatamente tocando el papel de filtro con el borde de la rejilla.
Luego, colóquelo en la gran gota de solución de manchas durante 30 segundos. Aquí se muestra una imagen TEM de plantillas de origami de ADN. La estructura del origami consta de dos 14 haces de hélice unidos entre sí por la hebra del andamio.
Aquí, se muestra una imagen TEM representativa de nanorods de oro. Las dimensiones medias de las nanorods de oro sintetizado son de 70 por 30 nanómetros. Esta imagen muestra dimers de nanorod de oro en el origami después del recocido.
Debido a su preferencia de unión a las rejillas TEM, los conjuntos de nanorod de oro de origami se ven generalmente como haces y varillas paralelas de origami. El protocolo permite altos rendimientos del ensamblaje de nanorods de oro en metamollas quirales con fuertes respuestas de dicroísmo circular plasmónico. Aquí se muestran los espectros de las estructuras cerradas y las estructuras abiertas.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran las propiedades ópticas plasmónicas de complejas nanoestructuras metálicas autoensambladas. Como se describe en el protocolo de texto, se utilizan varios productos químicos peligrosos en este método. Por favor, compruebe cuidadosamente la hoja de datos de seguridad del material y tome las precauciones necesarias.
