La estabilización biológica de las nanoestructuras de ADN es esencial para futuras aplicaciones in-vivo, como la administración de medicamentos dirigidos. Sin embargo, el ADN se degrada en el cuerpo por varias enzimas. Aquí presentamos una técnica de recubrimiento que protege las nanoestructuras del ADN de la degradación enzimática.
Las principales ventajas son que nuestro revestimiento comprende compuestos no tóxicos que ya se utilizan en organismos vivos y que la funcionalización de la superficie sigue siendo posible. Esta funcionalización es importante para incorporar sensores moleculares para el reconocimiento de objetivos e interruptores para la liberación de carga de drogas. Los recubrimientos de policación aumentan significativamente la absorción celular de estructuras encapsuladas de origami de ADN, por lo que este método puede abrir la puerta para aplicaciones de adn origamis en diagnósticos y terapias.
La absorción celular también es necesaria para posibles aplicaciones de administración de genes de la nanotecnología del ADN. Considero que el método es bastante sencillo y se puede dominar fácilmente. Para empezar, mida la concentración de origami de ADN purificado.
Utilice dos microlitros de tampón de TUBERCULOSis como el espacio en blanco para calibrar el espectrofotómetro ultravioleta. Y luego medir la concentración de origami de ADN a 260 nanómetros. A continuación, calcule las cantidades de fosfatos en la solución de origami de ADN purificado, utilizando la fórmula dos, como se describe en el manuscrito.
Preparar 15 microlitros de la estructura del origami de ADN incluyendo una nanomole de fosfato, utilizando tampón de tuberculosis para la dilución. Añadir 13,2 microlitros a la tuberculosis a 1,8 microlitros de quitosano. Y añadir 15 microlitros de la solución de quitosano a 15 microlitros del origami de ADN para desarrollar un poliplex de origami quitosano de origami con una relación N/P de ocho.
Continúe preparando poliplexes de diferentes relaciones N/P, utilizando cálculos como se describe en el manuscrito. Preparar 80 milímetros de un tubo para un gel de 2% de agarosa. Añadir 352 microlitros de cloruro de magnesio molar 2,5 y luego pre-mancharlo con 10 microlitros de mancha de gel de ADN.
Vierta la solución de gel en una caja de gel seca. Inserte un peine de electroforesis de gel y déjelo solidificar a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos. Mientras tanto, complementar el tampón de funcionamiento con 11 cloruro de magnesio milimiolar.
Mezcle de 10 a 20 microlitros de cada muestra con el 20% del búfer de carga 6X. Cargue las muestras en los pozos de gel de agarosa, incluyendo un origami de ADN desnudo como control. Ejecuta el gel a 70 voltios a temperatura ambiente durante dos horas y media a tres horas.
A continuación, utilice un escáner UV para visualizar el gel. Para realizar un ensayo de protección DNase I, añada cuatro microlitros de cada poliplex en comparación con diferentes relaciones N/P, 1,5 microlitros de búfer 10X DNase I, 8 microlitros de TB y 1,5 microlitros de DNase I a un tubo PCR separado de 2 mililitros. Luego incubar lo mismo a 37 grados centígrados en un termociclador durante 24 horas.
Para digerir DNase I, añadir dos microlitros de 20 miligramos por mililitros de proteínaS K e incubar durante 30 minutos a 37 grados centígrados en un termociclador. Luego, para desentrañar las nanoestructuras de ADN del núcleo añadir 3,6 microlitros de 50 miligramos por mililitro 40 kilodaltons dextran sulfato. A continuación, utilice estas muestras y el origami de ADN fresco como control para realizar la electroforesis de gel de agarosa como se describió anteriormente.
Exéminar la banda correspondiente a las muestras cargadas del gel. Para extraer el origami de ADN, utilice una columna de extracción de congelación por compresión y siga las instrucciones del fabricante y continúe con las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de manchas negativas como se describe en el manuscrito. Mezclar 6,5 microlitros de 36 nanómetros purificados HRP-NR con 6,5 microlitros de policaciones de diferentes concentraciones.
Para preparar un poliplex a proporciones N/P de uno, dos, cuatro, 10 y 20, prepare un grupo en blanco mezclando 6,5 microlitros de agua destilada con 6,5 microlitros de policaciones de varias concentraciones correspondientes a las relaciones N/P de uno, dos, cuatro, 10 y 20. A continuación, agregue 12,5 microlitros de cada una de estas soluciones preparadas a un pozo separado de una placa de 96 pozos. A continuación, agregue 72,5 microlitros de búfer HEPES a cada pozo y mezcle.
Añadir 10 microlitros de 15 ABTS milimotores y luego 5 microlitros de un peróxido de hidrógeno de 12 milimolares a cada pozo y mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Por último, utilice un lector de placas multimodo para medir la absorbancia a 421 nanómetros durante cuatro horas. Después de analizar poliplexes usando un ensayo de retardo de gel, hubo un cambio en la nanoestructura desnuda hacia el cátodo, probablemente debido al contrapeso de la carga negativa de los grupos de fosfato al unirse a las policaciones, y el aumento de tamaño del complejo.
Cuando se añadió una cantidad adicional de polianiones, como el sulfato de dextrán, se revirtió la formación de poliplex. El sulfato de dextrán de mayor peso molecular demostró ser más eficiente en comparación con un menor peso molecular. Después de analizar los poliplexes utilizando microscopía electrónica de transmisión de manchas negativas, los micrografías mostraron nanoestructuras de origami desnuda, poliplexes lineales de polietilenimina después de la decapsulación, poliplexes de chitosano, imágenes de origami de ADN desnudo y protegido sometidos a agotamiento de magnesio, degradación enzimática y digestión sérica.
En presencia de DNase I, después de dos horas, las nanoestructuras desnudas se digerieron por completo, mientras que los poliplexes lineales de polietilenimina de quitosano encapsulado de origami encapsulado se mantuvieron intactos en presencia de 10 unidades por mililitro DNase I.Los polileplexes lineales de polietilenimina protegen las nanoestructuras de ADN de manera más eficiente en comparación con el chitosan. Cuando se aumenta la relación N/P del poliplex, la digestión del ADN fue menor. Después de la enzima de recubrimiento, o después de un origami de ADN más funcionalizado, con poliplexes lineales de polietilenimina y quitosano en proporciones N/P variantes, no se observó ninguna interferencia notable con la actividad enzimática.
Por otro lado, la cinética de la enzima HRP cambió drásticamente después de unirse al origami del ADN. Es importante comenzar con estructuras de origami de ADN bien purificadas. Existe una hebra más estable que también puede unirse a las policaciones.
Son difíciles de separar de los poliplexes de origami de ADN. Nuestras moléculas de recubrimiento también se utilizan en aplicaciones de terapia génica. Esto significa que las nanoestructuras de ADN se pueden utilizar en el futuro para alterar el genoma de los organismos vivos.
Para la tinción de gel de agarosa, generalmente se utilizan moléculas que intercalan el ADN y son potencialmente mutagénicas. Por favor, siga las instrucciones de seguridad de su laboratorio al tinción de ADN.
