La forma estándar de obtener una célula madre de pulpa dental es poco eficiente, y esto depende de varias variables. Nuestro protocolo permitió obtener un aislamiento exitoso de células madre de dientes tratados en el 90% de los casos. Obtener un alto número de células en unas pocas semanas es la principal ventaja.
Eso nos permite utilizar la célula en la medicina regenerativa y crear un biobanco que proporciona a otros científicos esta útil herramienta. El procedimiento para abrir el diente será realizado por el Dr. Constantino Santacroce. Posteriormente, el protocolo será mostrado por Stefano Martellucci, el estudiante de doctorado de mi laboratorio, que es el primer autor del artículo.
Para empezar, extraiga el tercer molar del paciente, enjuáguelo rápidamente con PBS, coloque un tubo de ensayo de 15 mililitros con el medio y transfiérelo al laboratorio en menos de dos horas. Bajo una capucha de riesgo biológico, utilice un cortador para abrir el diente mediante un paso de corte coronal, paralelo y tangente, a través del techo de la cámara de pulpa. Con una pequeña excavadora, retire suavemente la pulpa y colóquela en un tubo de ensayo.
Luego, lavar con PBS tres veces, y centrifugar a 2,500 veces g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante. Resuspender el pellet en la solución de Hank, y transferir la muestra a un plato de Petri.
Retire la solución del Hank por centrifugación a 2.500 veces g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, con un bisturí desechable, divide la pulpa en rodajas de aproximadamente un milímetro, y agrega un mililitro de colagenasa tipo IV. A continuación, centrifugar la muestra a 2.500 veces g a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Retire el sobrenadante y resusppend el pellet en el medio. Cultivo en un matraz T25 específico para células madre a 37 grados Celsius en 5% dióxido de carbono. Durante el período de incubación, cambie el medio de cultivo cada tres días.
Una vez que las células adherentes alcancen la confluencia, agregue un mililitro de solución de trippsina-EDTA a las células para separarlas, e incubar las células a 37 grados centígrados durante tres minutos. A continuación, agregue cuatro mililitros del medio de cultivo en una proporción de uno a cinco para detener la acción de la trippsina, y centrifugar la suspensión celular a 259 veces g durante seis minutos. Retire el sobrenadante.
Luego, coloque las celdas en un matraz T25 para propagarlas. Luego, separa las células con un mililitro de trippsina-EDTA a 37 grados Celsius durante tres minutos. Centrifugar la suspensión celular a 259 g durante seis minutos.
Retire el sobrenadante y proceda a probar las células para el análisis citofluorimétrico. Para realizar el paso de silenciamiento de la proteína priónica transitoria, primero escalculmente las células madre de pulpa dental humana en placas de seis pozos con dos mililitros del medio de cultivo durante 24 horas. Luego, agregue 400 microlitros del pequeño medio de ARN PrP interferente a cada muestra, e incubarlos a 37 grados centígrados durante seis horas.
Sin descartar el medio siRNA PrP, agregue 1,6 mililitros del medio de cultivo en una proporción de uno a cinco, y deje las células a 37 grados centígrados durante 72 horas. Después del período de incubación, retire el sobrenadante y lave las células con dos mililitros de PBS tres veces a temperatura ambiente. Luego, agregue dos mililitros del medio de cultivo neuronal, y mantenga las células durante siete a 14 días en una incubadora a 37 grados centígrados.
Después del período de incubación, lavar las células con dos mililitros de PBS tres veces a temperatura ambiente, y proceder al análisis de manchas occidentales para probar los antígenos de la superficie neuronal. Para realizar el proceso de inducción neuronal, cultivo 2 millones de células madre de pulpa dental humana en placas de seis pozos, hasta 28 días desde la separación de la pulpa. Cada tres días, desecha el sobrenadante.
Lavar tres veces con dos mililitros de PBS a temperatura ambiente, y reemplazar dos mililitros del medio de cultivo neuronal. Después de siete a 14 días, separar las células con un mililitro de trippsina-EDTA a 37 grados Celsius durante tres minutos. A continuación, agregue cuatro mililitros del medio de cultivo en una proporción de uno a cinco para detener la acción de la trippsina.
Para caracterizar las células madre de pulpa dental humana por citometría de flujo, cultivo 2 millones por mililitro de las células en placas de seis pozos con dos mililitros del medio de cultivo. A los 28 días de separación de la pulpa post-dental o después de 14 días adicionales con medio de cultivo neuronal, agregue un mililitro de la tripina-EDTA a 37 grados centígrados durante tres minutos para separar las células. A continuación, agregue cuatro mililitros del medio de cultivo en una proporción de uno a cinco para detener la acción de la trippsina, y centrifugar a 259 veces g a temperatura ambiente durante seis minutos.
Fijar las células no tratadas o tratadas con 300 microlitros de 4%paraformaldehído en PBS a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, centrifugar, deseche el sobrenadante y permeabilice las células con un 1% de tensioactivo no iónico en PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos adicionales. Luego, centrífugas de nuevo, deseche el sobrenadante y realice el bloqueo con 5% de leche seca sin grasa en un mililitros de PBS a temperatura ambiente durante una hora.
Lavar tres veces con un mililitro de PBS, e incubar las células con anticuerpos monoclonales anti-CD105, anti-STRO-1, anti-CD90, anti-CD73, anti-beta-tres-tubulina, anti-NFH y anti-GAP43 a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, centrifugar las células de nuevo tres veces consecutivas con un mililitro de PBS a intervalos de seis minutos, y luego incubar con anticuerpos monoclonales antiratón PE o anti-conejo CY5 a temperatura ambiente durante una hora adicional. Utilice los anticuerpos secundarios para atajer las células inmunopositivas y analice todas las muestras con un citómetro de flujo.
Cultivo de 2 millones de células por mililitro de las células madre de pulpa dental humana en placas de seis pozos con dos mililitros del medio de cultivo. A los 21 y 28 días de separación de la pulpa post-dental o después de siete a 14 días adicionales con el medio de cultivo neuronal, agregue un mililitro de la trippsina-EDTA a 37 grados Celsius durante tres minutos para separar las células. Luego, centrífuga, deseche el sobrenadante, y luego fije los especímenes con 4%paraformaldehído en PBS a cuatro grados Celsius durante 10 minutos.
A continuación, centrifugar, deseche el sobrenadante y, a continuación, permeabilizar con 1%surfactante no iónico en PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos. Retire el sobrenadante y manche las células con anticuerpo monoclonal anti-PrP de conejo a temperatura ambiente durante una hora. Finalmente, centrífuga, deseche el sobrenadante, y luego incubar con anticuerpo monoclonal CY5 antiejen a temperatura ambiente durante una hora adicional.
Analice todas las muestras con un citómetro de flujo. Después de la separación de la pulpa, se ampliaron los racimos de células madre de pulpa dental humana en la periferia. Una comparación entre el crecimiento de estas células antes y después de la diferenciación neuronal inducida por EGF/bFGF mostró cambios significativos en la morfología celular y el crecimiento de las neuritas.
Las células madre de pulpa dental humana no tratadas expresaron antígenos de superficie específicos mesenquimales multipotentes, como CD44, CD90, CD105, CD73 y STRO-1. Después de los estímulos de inducción neuronal apropiados, estas células expresaron marcadores neuronales específicos, como beta-tres-tubulina, NFH, y GAP43. Las células no tratadas no expresaron marcadores hematopoyéticos, como CD14 y CD19.
Después de 28 días, la proteína priónica se expresó precozmente en células madre de pulpa dental humana en comparación con el control negativo correspondiente, y su expresión se incrementó después del proceso de diferenciación neuronal inducido por EGF/bFGF. El análisis de manchas occidentales mostró que silenciar la proteína prión por el ARN antes de que los estímulos de EGF/bFGF pudieran afectar el proceso de diferenciación neuronal de las células madre de pulpa dental humana al prevenir la expresión de marcadores neuronales beta-tres-tubulina y NHF. Lo más importante es la elección de la enzima para separar las células de la pulpa.
De hecho, si la enzima es demasiado agresiva, las células podrían dañarse y su capacidad de crecimiento y diferenciación podría verse comprometida. Las células madre de pulpa dental son un excelente modelo experimental que se puede emplear en estudios in vivo e in vitro en el campo de la medicina regenerativa. Dado que la PrP desempeña un papel clave en el proceso de diferenciación neuronal de las células madre de pulpa dental, este marcador puede ser un excelente candidato como objetivo eficaz en enfermedades neurodegenerativas.
El aspecto más importante a aconsejar es el estado de salud de los pacientes, como la ausencia de enfermedades infecciosas.
