A maneira padrão de obter uma célula-tronco da polpa dentária é pouco eficiente, e isso depende de várias variáveis. Nosso protocolo permitiu obter um isolamento bem sucedido de células-tronco de dentes tratados em 90% dos casos. Obter um alto número de células em poucas semanas é a principal vantagem.
Isso nos permite usar a célula em medicina regenerativa e criar um biobanco fornecendo a outros cientistas esta ferramenta útil. O procedimento para abertura do dente será realizado pelo Dr. Constantino Santacroce. Posteriormente, o protocolo será apresentado por Stefano Martellucci, o doutorando do meu laboratório, que é o primeiro autor do artigo.
Para começar, extrair o terceiro molar do paciente, enxágüe-o rapidamente com PBS, coloque um tubo de ensaio de 15 mililitros com o meio e transfira-o para o laboratório em menos de duas horas. Sob um capô de risco biológico, use um cortador para abrir o dente por uma passagem de corte coronal, paralela e tangente, através do teto da câmara de polpa. Com uma pequena escavadeira, retire suavemente a polpa e coloque-a em um tubo de ensaio.
Em seguida, lave com PBS três vezes, e centrífuga a 2.500 vezes g em temperatura ambiente por 10 minutos. Após a centrifugação, remova o supernatante. Resuspend a pelota na solução de Hank, e transfira a amostra para uma placa de Petri.
Remova a solução do Hank por centrifugação a 2.500 vezes g à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, com um bisturi descartável, divida a polpa em fatias de aproximadamente um milímetro e adicione um mililitro de colagem tipo IV. Em seguida, centrifugar a amostra a 2.500 vezes g em temperatura ambiente por 10 minutos.
Remova o supernatante e resuspense a pelota no meio. Cultuá-lo em um frasco T25 específico para células-tronco a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Durante o período de incubação, mude o meio cultural a cada três dias.
Uma vez que as células aderentes atinjam a confluência, adicione um mililitro da solução trypsin-EDTA às células para descolá-las, e incubar as células a 37 graus Celsius por três minutos. Em seguida, adicione quatro mililitros do meio de cultura em uma proporção de um a cinco para parar a ação de trippsina, e centrifugar a suspensão da célula a 259 vezes g por seis minutos. Remova o supernatante.
Em seguida, coloque as células em um frasco T25 para se propagar. Em seguida, desprende as células com um mililitro de trippsin-EDTA a 37 graus Celsius por três minutos. Centrifugar a suspensão da célula a 259 vezes g durante seis minutos.
Remova o supernascedor e prossiga para testar as células para análise citofluormétrica. Para realizar o passo de silenciamento da proteína prion transitória, primeiro cultura as células-tronco de polpa dentária humana em placas de seis poços com dois mililitros do meio cultural por 24 horas. Em seguida, adicione 400 microliters do pequeno RNA PrP médio interferindo a cada amostra, e incuba-os a 37 graus Celsius por seis horas.
Sem descartar o meio siRNA PrP, adicione 1,6 mililitros do meio de cultura em uma proporção de um a cinco, e deixe as células a 37 graus Celsius por 72 horas. Após o período de incubação, remova o sobrenante e lave as células com dois mililitros de PBS três vezes à temperatura ambiente. Em seguida, adicione dois mililitros do meio de cultura neuronal, e mantenha as células por sete a 14 dias em uma incubadora a 37 graus Celsius.
Após o período de incubação, lave as células com dois mililitros de PBS três vezes à temperatura ambiente, e prossiga para a análise de manchas ocidentais para testar antígenos da superfície neuronal. Para realizar o processo de indução neuronal, cultura 2 milhões de células-tronco de polpa dentária humana em placas de seis poços, até 28 dias da separação da polpa. A cada três dias, descarte o supernaspe.
Lave três vezes com dois mililitros de PBS à temperatura ambiente, e substitua dois mililitros do meio de cultura neuronal. Após sete a 14 dias, desprende as células com um mililitro de trippsin-EDTA a 37 graus Celsius por três minutos. Em seguida, adicione quatro mililitros do meio de cultura em uma proporção de um a cinco para parar a ação de trypsin.
Para caracterizar as células-tronco da polpa dentária humana por citometria de fluxo, cultura 2 milhões por mililitro das células em placas de seis poços com dois mililitros do meio de cultura. Aos 28 dias de separação da polpa pós-dentária ou depois de 14 dias adicionais com meio de cultura neuronal, adicione um mililitro da trippsina-EDTA a 37 graus Celsius por três minutos para desacoplar as células. Em seguida, adicione quatro mililitros do meio de cultura em uma proporção de um a cinco para parar a ação de trippsina, e centrifugar a 259 vezes g à temperatura ambiente por seis minutos.
Fixar as células não tratadas ou tratadas com 300 microlitrais de 4% de paraformaldeído em PBS a quatro graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, centrífuga, descarte o supernasce e permeabilifique as células com surfactante 1% não iônico na PBS à temperatura ambiente por mais 10 minutos. Em seguida, centrífuga novamente, descarte o supernascente, e realize o bloqueio com 5% de leite seco sem gordura em um mililitro de PBS à temperatura ambiente por uma hora.
Lave três vezes com um mililitro de PBS, e incuba as células com anticorpos anti-CD105, anti-CD44, anti-STRO-1, anti-CD90, anti-CD73, anti-beta-três-tubulin, anti-NFH e anticorpos monoclonais anti-GAP43 à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, centrifugar as células novamente três vezes consecutivas com um mililitro de PBS em intervalos de seis minutos, e, em seguida, incubar com anticorpos monoclonais anti-rato PE ou anti-coelho CY5 à temperatura ambiente por uma hora adicional. Use os anticorpos secundários para gating das células imuno-positivas, e analise todas as amostras com um citômetro de fluxo.
Cultura 2 milhões de células por mililitro das células-tronco da polpa dentária humana em placas de seis poços com dois mililitros do meio cultural. Aos 21 e 28 dias de separação da polpa pós-dentária ou depois de mais sete a 14 dias com o meio de cultura neuronal, adicione um mililitro da trippsina-EDTA a 37 graus Celsius por três minutos para desacoplar as células. Em seguida, centrífuga, descarte o supernasce e, em seguida, fixe os espécimes com 4% de paraformaldeído em PBS a quatro graus Celsius por 10 minutos.
Em seguida, centrífuga, descarte o supernaspeuta e, em seguida, permeabilize com surfactante 1% não iônico na PBS à temperatura ambiente por 10 minutos. Remova o supernatante e manche as células com anticorpo monoclonal anti-PrP de coelho à temperatura ambiente por uma hora. Finalmente, centrífuga, descarte o supernasce e, em seguida, incubar com anticorpo monoclonal anti-coelho CY5 à temperatura ambiente por mais uma hora.
Analise todas as amostras com um citômetro de fluxo. Após a separação da polpa, os aglomerados de células-tronco de polpa dentária humana foram expandidos na periferia. Uma comparação entre o crescimento dessas células antes e depois da diferenciação neuronal induzida pelo EGF/bFGF mostrou mudanças significativas na morfologia celular e no crescimento dos neurites.
Células-tronco de polpa dentária humana não tratadas expressaram antígenos superficiais mesenquimais mesenquimais multipotentes, como CD44, CD90, CD105, CD73 e STRO-1. Após estímulos de indução neuronal apropriados, essas células expressaram marcadores neuronais específicos, como beta-três-tubulina, NFH e GAP43. Células não tratadas ou tratadas não expressaram marcadores hematopoiéticos, como CD14 e CD19.
Após 28 dias, a proteína prion foi expressa precocemente em células-tronco de polpa dentária humana em comparação com o controle negativo correspondente, e sua expressão foi aumentada após o processo de diferenciação neuronal induzido pelo EGF/bFGF. A análise da mancha ocidental mostrou que silenciar a proteína prion por sRNA antes dos estímulos EGF/bFGF poderia afetar o processo de diferenciação neuronal das células-tronco de polpa dentária humana, impedindo a expressão de marcadores neuronais beta-três-tubulina e NHF. O mais importante é a escolha da enzima para separar as células da polpa.
Na verdade, se a enzima é muito agressiva, as células podem ser danificadas e sua capacidade de crescimento e diferenciação pode ser comprometida. As células-tronco da polpa dentária são um excelente modelo experimental que pode ser empregado em estudos in vivo e in vitro no campo da medicina regenerativa. Uma vez que a PrP desempenha um papel fundamental no processo de diferenciação neuronal das células-tronco da polpa dentária, este marcador pode ser um excelente candidato como alvo eficaz em doenças neurodegenerativas.
O aspecto mais importante a ser aconselheira é a condição de saúde dos pacientes, como a ausência de doenças infecciosas.
