치과 펄프에서 줄기 세포를 얻는 표준 방법은 제대로 효율적이며, 이것은 몇 가지 변수에 따라 달라집니다. 우리의 프로토콜은 케이스의 90%에서 처리된 치아에서 줄기 세포의 성공적인 격리를 얻는 것을 허용했습니다. 몇 주에 세포의 높은 수를 얻는 것이 주요 이점입니다.
이를 통해 우리는 재생 의학에서 세포를 사용하고 다른 과학자들에게 이 유용한 도구를 제공하는 바이오 뱅크를 만들 수 있습니다. 치아를 여는 절차는 콘스탄티노 산타크로체 박사가 수행합니다. 그 후, 프로토콜은 스테파노 마르텔루치에 의해 표시됩니다, 내 실험실에서 박사 과정 학생, 누가 기사의 첫 번째 저자입니다.
시작하려면 환자에게서 세 번째 어금니를 추출하고, PBS로 빠르게 헹구고, 배지로 15 밀리리터 테스트 튜브에 넣고, 2시간 이내에 실험실로 이송합니다. 생물학적 위험 후드 아래에서 커터를 사용하여 펄프 챔버의 지붕을 통해 관상 절단 패스, 평행 및 접선으로 치아를 엽니다. 작은 굴삭기로 펄프를 부드럽게 제거하고 테스트 튜브에 놓습니다.
그런 다음 PBS로 세 번, 원심분리기를 실온에서 2, 500g에서 10분간 세척합니다. 원심 분리 후, 상체를 제거합니다. 행크의 용액에서 펠릿을 다시 중단하고 샘플을 페트리 접시로 옮킨다.
행크의 용액을 실온에서 2, 500배 에서 10분 동안 원심분리하여 제거합니다. 그런 다음 일회용 메스를 사용하면 펄프를 약 1mm 슬라이스로 나누고 IV 콜라게나아제 타입의 밀리리터를 추가합니다. 다음으로, 10분 동안 실온에서 2, 500배 g의 원심분리기.
상체를 제거하고 매체에서 펠릿을 다시 분리합니다. 5%의 이산화탄소에서 섭씨 37도에서 줄기 세포에 특이적인 T25 플라스크에서 배양합니다. 인큐베이션 기간 동안, 3일마다 배양 배지를 변경한다.
부착 세포가 합류에 도달하면, 그들을 분리하기 위해 세포에 트립신-EDTA 용액의 1 밀리리터를 추가하고 3 분 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양하십시오. 다음으로, 배양 배지의 4밀리리터를 1대 5 비율로 추가하여 트립신 작용을 중지하고, 6분 동안 259배 g의 세포 현탁액을 원심분리한다. 상부체를 제거합니다.
그런 다음, 전파T25 플라스크에 세포를 배치합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 트립신-EDTA 1 밀리리터로 세포를 3분간 분리합니다. 6 분 동안 259 배 g에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다.
상체를 제거하고 세포불피 분석을 위해 세포를 테스트합니다. 일시적인 프리온 단백질 침묵 단계를 수행하기 위해, 먼저 인간 치과 펄프 줄기 세포를 배양하여 배양 배지의 2밀리리터를 24시간 동안 배양한다. 그런 다음, 각 샘플에 작은 간섭 RNA PrP 배지의 400 마이크로리터를 추가하고 6 시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.
siRNA PrP 배지를 폐기하지 않고, 배양 배지의 1.6 밀리리터를 1대 5 비율로 추가하고, 세포를 섭씨 37도에서 72시간 동안 둡니다. 인큐베이션 기간 이후에는 상체를 제거하고 실온에서 PBS 2밀리리터로 셀을 세워주세요. 그런 다음, 신경 배양 배지의 2 밀리리터를 추가하고, 섭씨 37도에서 인큐베이터에서 7~14일 동안 세포를 유지한다.
인큐베이션 기간 후 실온에서 PBS2밀리리터로 세포를 세척하고 서부 블롯 분석을 진행하여 뉴런 표면 항원 검사를 진행한다. 신경 유도 과정을 수행하기 위해, 배양 2 백만 인간의 치과 펄프 줄기 세포 6 잘 플레이트에서, 펄프 분리에서 최대 28 일. 3일마다 상체를 버리십시오.
실온에서 PBS2밀리리터로 3회 세척하고, 뉴런 배양 배지의 2밀리리터를 교체한다. 7~14일 후에는 섭씨 37도에서 트립신-EDTA 1밀리리터로 세포를 3분간 분리합니다. 그런 다음 배양 배지의 4밀리리터를 1대 5 비율로 추가하여 트립신 동작을 중지합니다.
인간 치과 펄프 줄기 세포를 유동 세포측정에 의한 특성화하기 위해, 배양 배지의 2밀리리터를 가진 6웰 플레이트에서 세포의 밀리리터당 2백만 배양. 28 일 치과 후 펄프 분리 또는 뉴런 배양 배지와 함께 추가 14 일 후, 세포를 분리하는 3 7 섭씨 37도에서 트립신-EDTA의 1 밀리리터를 추가합니다. 다음으로, 배양 배지의 4밀리리터를 1대 5 비율로 추가하여 트립신 작용을 중지하고, 원심은 실온에서 259배 g에서 6분 동안 한다.
PBS에서 4%의 파라포름알데히드300마이크로리터를 10분 동안 섭씨 4도에 고정합니다. 다음으로, 원심분리기는 상온에서 PBS에서 1%비이온 계면활성제로 세포를 10분 간 추가로 퍼미크하게 한다. 그런 다음 원심분리기를 다시 폐기하고, 상온에서 PBS의 1밀리리터에서 5%의 무지방 건조 우유로 블로킹을 수행합니다.
PBS의 1 밀리리터로 세 번 세척하고, 안티 CD105, 안티 -CD44, 안티 스트로 - 1, 안티 CD90, 안티 CD73, 안티 베타 - 3 튜룰린, 안티 NFH, 및 반 GAP43 단일 클론 항체를 1 시간 동안 으로 배양. 다음으로, 세포를 6분 간격으로 PBS 1밀리리터로 3회 연속으로 다시 3회 연속한 다음, 실온에서 항마우스 PE 또는 항토끼 CY5 모노클론 항체로 배양한다. 면역 양성 세포를 게이팅하기 위해 이차 항체를 사용하고 유동 세포계로 모든 샘플을 분석하십시오.
배양 배지의 2밀리리터를 가진 6웰 플레이트에서 인간 치과 펄프 줄기 세포의 밀리리터 당 2백만 개의 세포를 배양한다. 21 일과 28 일 치과 후 펄프 분리 또는 뉴런 배양 배지와 함께 7 ~ 14 일 추가 후, 세포를 분리하는 3 분 동안 섭씨 37도에서 트립신-EDTA의 1 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 원심분리기를 폐기한 다음 PBS에서 4%의 파라포름알데히드로 표본을 10분 동안 섭씨 4도에 수정합니다.
다음으로, 원심분리기는 상주체를 버린 다음 실온에서 PBS에서 1%가 아닌 계면활성제로 10분 동안 퍼메아빌화한다. 상체를 제거하고 토끼 안티 PrP 단일 클론 항체로 세포를 실온에서 1 시간 동안 얼룩지게하십시오. 마지막으로, 원심분리기는 상체를 폐기한 다음 실온에서 토끼 CY5 모노클론 항체를 추가로 배양한다.
유동 세포계로 모든 샘플을 분석합니다. 펄프 분리 후, 인간 치과 펄프 줄기 세포의 클러스터는 주변에 확장되었다. EGF/bFGF에 의해 유도된 신경 분화 전후에 이들 세포의 성장 사이의 비교는 세포 형태와 중성염에 있는 중요한 변화를 보여주었습니다.
치료되지 않은 인간 치과 펄프 줄기 세포는 CD44, CD90, CD105, CD73 및 STRO-1과 같은 다능성 중간엽 기질 특정 표면 항원들을 발현하였다. 적절한 신경 유도 자극 후, 이러한 세포는 베타-3-tubulin, NFH 및 GAP43과 같은 특정 신경 마커를 발현하였다. 처리되지 않은 세포 또는 처리된 세포는 CD14 및 CD19와 같은 조혈 마커를 발현하지 않았다.
28일 후, 프리온 단백질은 해당 음성 조절에 비해 인간 치과 펄프 줄기 세포에서 조숙하게 발현되었고, EGF/bFGF에 의해 유도된 뉴런 분화 과정 이후에 그 발현이 증가하였다. 서양 얼룩 분석은 EGF/bFGF 자극 전에 sRNA에 의한 프리온 단백질을 침묵시키는 것은 신경 마커 베타-3-튜룰린 및 NHF의 발현을 방지함으로써 인간 치과 펄프 줄기 세포의 신경 분화 과정에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었다. 가장 중요한 것은 펄프에서 세포를 분리하는 효소의 선택입니다.
사실, 효소가 너무 공격적이면 세포가 손상될 수 있으며 성장과 분화 능력이 손상될 수 있습니다. 치과 펄프 줄기 세포는 재생 의학 분야에서 생체 내 및 체외 연구에 사용할 수있는 우수한 실험 모델입니다. PrP는 치과 펄프 줄기 세포의 신경 분화 과정에 중요한 역할을하기 때문에,이 마커는 신경 퇴행성 질환에서 효과적인 대상으로 우수한 후보가 될 수 있습니다.
조언해야 할 가장 중요한 측면은 전염병의 부재와 같은 환자의 건강 상태입니다.
