Nuestro protocolo proporciona métodos alternativos para la identificación y caracterización de factores de huésped virales, nucleolares y no nucleolares que mantienen el ciclo infeccioso DEL VIH-1. Los conceptos utilizados en este enfoque son aplicables a otros modelos virales y de enfermedades que requieren la caracterización de vías subesteudiadas. Las técnicas de solución de problemas se describen para modificar otros modelos de proteínas.
Al demostrar el procedimiento se mostrarán Haitang Li y Pritsana Chomchan, científicos del Departamento de Biología Molecular y Celular del Instituto de Investigación Beckman de la Ciudad de la Esperanza, y Roger Moore, miembros del Núcleo de Proteómica de la Ciudad de la Esperanza y del Departamento de Inmunología Molecular. Comience por cultivar un cultivo de línea celular HeLa que expresa de forma estable el HLfB en tres placas de cultivo de 100 milímetros a una densidad de dos veces a 10 a seis células por mililitro. Cuando las células alcancen la concentración adecuada, mezcle 20 microgramos de plásmido que contengan la señal de localización nucleolar Rev mutación de tres banderas de interés con 1,76 mililitros de TE 79/10 en un tubo de 15 mililitros, seguido de la adición de 240 microlitros de cloruro de calcio bipolar, con mezcla a fondo.
A continuación, transfiera el contenido del tubo por gota en un nuevo tubo de 15 mililitros que contenga dos mililitros de 2x HBS, seguido de la mezcla en una máquina de vórtice. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, vórtice la precipitación. Agregue un mililitro de la suspensión por gota a cada una de las tres placas de cultivo HLfB de 100 milímetros mientras gira suavemente el medio.
Después de una incubación de seis horas en la incubadora de cultivo celular, reemplace la mezcla de transfección con 10 mililitros de medio de cultivo fresco, y devuelva las células a la incubadora durante otras 42 horas. 48 horas después de la transfección, coloque cada plato sobre un lecho de hielo dentro de una capucha de cultivo de tejido de nivel dos de riesgo biológico. Retire el medio de cultivo celular y enjuague suavemente las células con 10 mililitros de PBS prechilled, sin interrumpir las capas celulares.
Deseche el PBS después de enjuagar las células. A continuación, tratar las células con un mililitro de tampón de lelisis, complementado con cóctel inhibidor de la proteasa, por plato. Inclinando las placas para recoger las células en una piscina, utilice un rascador de celdas para interrumpir manualmente las capas.
Usando una micropipeta de 1.000 microlitros, acope el éltato de cada plato en un tubo prechilled, de 15 mililitros para una incubación de 15 minutos sobre hielo, con vórtice cada cinco minutos. Al final de la incubación, aliquot los lysates en tres tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, y recoger los lysates por centrifugación. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 mililitros y obtenga la concentración de izado de proteína viral, como se describe en el manuscrito.
Para la coimmunoprecipitación de la señal de localización nucleolar Rev bandera de tres primos, enjuague 25 microlitros de perlas de gel de afinidad M2 tres veces con 500 microlitros de tampón de lisis fresca, complementado con cóctel inhibidor de la proteasa, por lavado. Realice estos pasos en una sala fría o con los reactivos sobre hielo. Después del último enjuague, agregue una concentración de un miligramo por mililitro de licato de proteína viral a las cuentas enjuagadas en un volumen final de cinco mililitros de tampón de lysis.
Incubar la reacción durante tres horas a cuatro grados centígrados con rotación. Al final de la incubación, pele el pellet de las proteínas virales con perlas conjugadas con izado por centrifugación. Recoger el sobrenadante para la medición de la concentración de proteína de izado post-inmunoprecipitación.
Consulte el manuscrito para obtener instrucciones de almacenamiento de muestras. Añadir 750 microlitros de tampón de lelisis al pellet de perla conjugado con élicato de proteína viral, transferir las perlas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y lavar las perlas de un rotador durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Recoger las perlas por centrifugación para un adicional de dos lavados en el rotador, como acaba de demostrar.
Después del último lavado, usa una punta de carga de gel pellizcada, larga y pellizcada para eliminar cualquier rastro de tampón de lelisis del complejo de la vacunación de los cuentas. Resuspender las perlas en 55 microlitros de 2x tampón de carga. Luego, hierva la muestra a 95 grados centígrados durante 10 minutos.
Cargue 25 microlitros de eluido en un gel de mancha occidental y un gel SDS-PAGE de Coomassie. Después de completar la electroforesis de gel SDS-PAGE, enjuague el gel tres veces en 25 mililitros de agua ultrapura durante 15 minutos. Después del último lavado, agregue 100 mililitros de reactivo de tinción de Coomassie al gel.
Consulte el manuscrito para ver el protocolo de tinción completo. Para la digestión de las bandas de gel, primero utilice una cuchilla de afeitar limpia para cortar las bandas de gel de todo el carril del gel, que representa cada mutación, en cubos de aproximadamente cinco milímetros. Coloque cada banda en un tubo limpio de microcentrífuga de 0,5 mililitros.
Cubra las bandas dos veces con bicarbonato de amonio de 100 mililitrolares en una solución de acetonitrilo a agua de uno a uno a temperatura ambiente durante 15 minutos por lavado. Luego, seque las piezas de gel durante cinco minutos en una centrífuga al vacío. Para reducir las proteínas, cubra las piezas de gel seco con ditiotrotanio de 10 mililitrolares en bicarbonato de amonio 100 mililitrolar durante una hora de incubación a 56 grados centígrados, seguido de alquilación en 100 mililitrolado de yodoacamida en agua durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad.
A continuación, encoger y reespolar las piezas de gel dos veces con acetonitrilo, seguido de bicarbonato de amonio 100 millilolar, ambos con agitación suave a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después del segundo reswelling, seque las piezas de gel durante cinco minutos en una centrífuga de vacío. Hincha las piezas de gel con 50 nanogramos por microlitro de trippsina modificada de grado de secuenciación en bicarbonato de amonio de 100 mililitrolares.
Después de cinco minutos, cubra las piezas de gel con bicarbonato de amonio de 100 mililitrolares, y permítales que se relacionen por completo, añadiendo bicarbonato de amonio adicional de 100 mililitrolares para que las piezas de gel hinchadas estén completamente cubiertas. Luego, incubar las piezas de gel durante la noche a 37 grados Celsius, deteniendo la reacción con 1/10 del volumen de las muestras con 10% de ácido fórmico en agua a la mañana siguiente, y recoger el sobrenadante de cada tubo. La señal de localización nucleolar Rev de tres primos es detectable bajo tres condiciones diferentes de tampón de lelisis que contienen varias concentraciones de cloruro de sodio.
B23 también es detectable en tampón de lelisis que contiene la menor concentración de sal, apenas detectable en tampón de lelisis que contiene la concentración media de sal, e indetectable en tampón de lelisis que contiene una alta concentración de sal. La detección de B23 es óptima en el tampón de lisias que contiene la baja concentración de cloruro de sodio con bandera de tres primos Rev de tipo salvaje y pierde afinidad con la señal de localización nucleolar Rev M1 de tres primeros ministros. La afinidad B23 con el indicador de tres primos Rev de tipo salvaje también disminuye con una mayor concentración de sal, y el control negativo de ADDNA no produce inmunodetección inespecífico después de la inmunoprecipitación en ambas condiciones de tampón de la lesis.
La señal de localización nucleolar Rev marca de tres primos es más detectable después de la elución a través de la ebullición en tampón de carga de muestra 2x, mientras que B23 es detectable bajo las condiciones de incubación de la muestra de 37 y 95 grados Celsius. Después de la inmunoprecipitación y la tinción de plata, como se ha demostrado, las señales de localización nucleolares Rev y Rev de tipo salvaje M2, M6 y M9 son detectables a 18 kilodaltones. Las bandas correspondientes a la proteína B23 también se observan en el marcador de 37 kilodalton.
La tinción con reactivo Coomassie demuestra además la capacidad de detección de la señal de localización nucleolar Rev de tres primeros indicadores en presencia y ausencia de mutaciones a 18 kilodaltons. Utilice tantos controles, tanto positivos como negativos, como sea necesario para las referencias que pertenecen a su modelo de enfermedad durante el proceso de solución de problemas y cribado de posibles factores de enlace. Todas las mutaciones de deleción y de un solo punto pueden ser examinadas para detectar actividad dominante-negativa a través de la multimerización con Rev de tipo salvaje y utilizadas en la detención de la replicación del VIH-1.
