La mayoría de las plantas en la naturaleza probablemente están interconectadas por hongos simbióticos que habitan las raíces llamados hongos micorrizas. Este método examina explícitamente cómo las redes micorrizas comunes influyen en las interacciones de las plantas y las consecuencias ecológicas subsiguientes. Con este método, podemos examinar explícitamente el papel de las redes micorrizas comunes al tiempo que permitimos que todas las plantas sean colonizadas por hongos, en lugar de excluir hongos, lo que resulta en plantas de mal crecimiento.
Para comenzar a modificar los contenedores de plántulas tubulares comerciales con plástico flexible, utilice una prensa de perforación y sostenga el recipiente contra una valla en la prensa de perforación, y tenga una parada con una espiga corta que se ajuste dentro del contenedor para ayudar a mantenerlo en su lugar durante la perforación. Luego, taladre dos agujeros, uno por encima del otro, en los lados del contenedor, de modo que los agujeros estén separados por aproximadamente un centímetro. Corte la pieza delgada restante de plástico entre los agujeros para hacer una abertura alargada, de unos dos centímetros de ancho, y cinco centímetros de largo.
Repita el corte de estas aberturas alargadas en el lado opuesto del recipiente. Para cubrir las ranuras con malla de nylon, corte la malla de poro de 40 micrómetros en tantas piezas de 9,5 centímetros por 8,5 centímetros como contenedores. A continuación, utilizando pegamento caliente industrial de alta resistencia, sujetar la malla de nylon externamente en los recipientes para cubrir ambas aberturas, con cierta ligera superposición en la tela.
Aplique pegamento caliente alrededor de las aberturas en el recipiente, y a lo largo de los bordes largos en la malla de nylon, y enrolle el recipiente sobre la malla de nylon, y la membrana hidrófoba, cuando se utiliza, para evitar quemar los dedos. Agregue una capa de pegamento a lo largo del borde de la tela donde los bordes de la malla se superponen, y presione el borde sobre un poco de cartón para sellarlo firmemente. Una vez que el pegamento se haya enfriado, utilice cinta flexible para fijar los extremos superior e inferior de la tela al recipiente, para evitar bordes sueltos y rasgados.
Usando la misma cinta, cubra los pequeños agujeros en los lados del extremo cónico de cada recipiente para evitar el crecimiento de la raíz del recipiente en el resto de la olla. Coloque un mármol de vidrio en la parte inferior de cada recipiente para evitar la pérdida de suelo mientras proporciona drenaje, y luego ensamble las ollas como se describe en el manuscrito. Utilice recipientes sólidos y no modificados para un tratamiento de control que no implique ningún potencial para que se forme una CMN entre plantas.
Añadir el inóculo de hongos AM al suelo, mezclando uniformemente trozos de raíz picada de 1,2 centímetros de largo a fondo con el suelo. Seleccione un suelo deseado mezclado con una arena de sílice infértil o cuentas de vidrio para disminuir la concentración de nutrientes minerales disponibles para las plantas. Coloque los recipientes llenos en espuma perforada previamente construida en las ollas.
Para hacer una mezcla de arena de sílice pobre en nutrientes de drenaje adecuado, mezcle arena de tamaño de partícula medio con arena de tamaño de partícula pequeña en una mezcladora de cemento. Llene el espacio intersticial con esta mezcla usando un embudo para ayudar a llenar espacios pequeños. A continuación, el pretratamiento de trasplante, o las llamadas plantas de enfermería, de las especies deseadas en cada recipiente para sostener los hongos AM, que se propagarán entre los contenedores y establecerán redes micorrizas comunes.
Cultivar las plantas durante dos o tres meses a aproximadamente 24 grados centígrados en un invernadero para permitir el establecimiento de CMN. Coser plantas experimentales mediante la siembra en recipientes. Espere hasta que todos los recipientes hayan germinado plántulas antes de retirar las plantas de enfermería de pretratamiento, recortando sus brotes.
Para establecer tratamientos CMN, deje algunos recipientes no movidos durante el experimento. Para cortar físicamente las hifas que se extienden entre los contenedores modificados, gire algunos de los contenedores semanalmente, asegurándose de hacerlo a través de una rotación completa, para evitar alterar involuntariamente las interacciones sobre el suelo. Inmediatamente después de la rotación, regar fuertemente todas las macetas para restablecer el contacto entre el sustrato intersticial y los lados de los recipientes.
Remojar todas las macetas con agua después de cortar las redes micorrizas comunes es fundamental para restablecer el contacto entre el recipiente y el sustrato intersticial, evitando así la aireación involuntaria de los recipientes. Fertilizar las plantas vecinas con 0.5%nitrógeno 15 enriquecido nitrato de potasio, y cloruro de amonio. Fertilizar al individuo objetivo con un fertilizante de nitrógeno 14 de igual concentración.
Re-aleatorizar las posiciones de los macetas en el transcurso del experimento, al menos mensualmente. Mida el crecimiento semanalmente midiendo la longitud más larga de la hoja, para monitorear cuando el crecimiento comienza a disminuir, asegurándose de cosechar antes de que las plantas se encuadernan en la raíz. Para cosechar, cortar todo el tejido sobre el suelo, y colocar plantas individuales en sobres etiquetados con su tratamiento, maceta y posición.
Luego seque los tejidos sobre el suelo a 60 grados Celsius en un horno de secado al aire forzado, a peso constante, y luego medir el peso seco de cada tejido vegetal. Deje que el suelo se seque de dos a tres días antes de retirar los recipientes, y cosechar las raíces. Después de la cosecha, cepillar suavemente tanto tierra como sea posible de los sistemas radiculares.
Lavar las raíces en un tamiz con un tamaño de poro de 250 micras, para evitar la pérdida de raíz. Después de permitir que las raíces se sequen al aire, pese todo el sistema radicular. Recorte el sistema radicular aleatoriamente y coloque los fragmentos en 50%etanol.
Vuelva a pesar el sistema radicular restante y guárdelo en un sobre de papel etiquetado para que se seque a 60 grados centígrados para la evaluación del peso seco. Al cultivar Andropogon gerardii Vitman en un experimento de planta objetivo, cortar o prevenir CMN disminuyó el peso seco sobre el suelo del objetivo, lo que sugiere que las CMN intactas promovieron el crecimiento de las plantas. Las plantas con CMN cortadas y sin CMN respondieron de manera similar a sus tratamientos.
La competencia, en la que el crecimiento de un individuo suprime el crecimiento de otro individuo cercano, se detectó en el tratamiento intacto de CMN, pero no en los tratamientos de CMN cortados o sin cmN. Las comparaciones exhaustivas de diferentes concentraciones de tejido de hojas de nutrientes minerales, frente a las concentraciones de manganeso de tamaño de las plantas, se asociaron positivamente con pesos secos sobre el suelo de la planta objetivo, en todos los tratamientos. Se evaluó el tejido vegetal objetivo para el nitrógeno 15 en los tejidos de las hojas frente al tamaño de la planta, después de agregar nitrógeno 15 etiqueta sólo a los contenedores de los vecinos.
Las plantas objetivo con CMN intactas tenían concentraciones de nitrógeno 15 más altas, en comparación con otros dos tratamientos. Las CMN intactas tenían una pendiente de nitrógeno muy positiva y significativamente diferente, a partir de la del tratamiento de CMNs cortados, lo que sugiere que las plantas grandes obtuvieron más nitrógeno de las CMN que llegaban a los contenedores vecinos, que los individuos pequeños objetivo. En un experimento de campo utilizando núcleos girados hechos de tubería de PVC, el micelio extraradical más allá de las tuberías tuvo poco efecto en el crecimiento de la jabalí durante el experimento de 13 meses.
Sin embargo, cortarlo por rotación de tuberías redujo las concentraciones foliares de nitrógeno, fósforo y cobre, sustancialmente mostradas por las plantas cloroticas. Gire los recipientes en la misma dirección en la que la tela se pega en cada recipiente para evitar el desgarro de la tela, y gire 360 grados para reducir los cambios en el suelo de las plantas. Este procedimiento se puede utilizar en el campo con tubos de PVC modificados llenos de suelo estéril para examinar el papel del micelio extraradical en la colonización de la raíz, y su influencia en la absorción de nutrientes.
Esta técnica permite la comparación de plantas con redes micorrizas comunes, con plantas micorrizas que no están interconectadas por redes, en lugar de a plantas pequeñas sin micorrizas, como se hace con mayor frecuencia.
