Aunque innumerables microbios colonizan las raíces de las plantas, estas interacciones son difíciles de analizar a medida que ocurren bajo tierra. Para facilitar esto, esta colección de protocolos proporciona una visión general de las estrategias para inocular las raíces de las plantas con microbios transmitidos por el suelo. La inoculación radicular es la base para estudiar las interacciones de los microbios radiculares, y mediante el uso de las siguientes técnicas, las interacciones se pueden estudiar a nivel molecular, citológico o histológico.
Explicamos tres sistemas de inoculación utilizando verticillium como microbio invasor de la raíz, y la planta modelo, arabidopsis. Sin embargo, es posible la transferencia de los métodos a otras plantas, como el tomate o la colza, y a otros microbios de la raíz, por ejemplo, la serendipita beneficiosa. Prepare el inóculo verticillium con anticipación cultivando el micelio en PDB e induciendo la esporulación y el caldo de dextrosa Czapek.
Luego comience vertiendo el medio en autoclave en placas de Petri. Después del endurecimiento del medio, vuelva a empacar las placas de Petri en una bolsa de plástico estéril y guárdelas boca abajo durante la noche en el refrigerador a cuatro a 10 grados centígrados. Cortar y retirar un canal de infección en el tercio superior del medio solidificado con un bisturí.
Evite obtener líquido o aire debajo del medio de agar mientras corta. A continuación, use una punta de pipeta estéril para distribuir de 50 a 100 semillas de arabidopsis esterilizadas en la superficie cortada. Coloque las semillas en el ángulo donde la superficie del agar cortado entre en contacto con la pared de la placa de Petri para que las raíces puedan crecer entre ellas.
Cierre las placas de Petri y séllelas con una cinta adhesiva transpirable para permitir el intercambio de gases. Mantenga las placas de Petri en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante dos días para la estratificación para garantizar una germinación sincronizada y eficiente. Luego coloque las placas verticalmente en un estante y cultive las plantas en una cámara de crecimiento en condiciones de día largo.
Después de nueve a 11 días, cuando las raíces llegan al canal de infección, coloque las placas horizontalmente y ábralas. Luego agregue 500 microlitros de Verticillium conidia recién cosechado directamente en el canal de infección. Prepare placas de control agregando 500 microlitros de una solución simulada en lugar de esporas.
Incubar las placas de control y las inoculadas de esporas horizontalmente hasta que el líquido se haya empapado. Luego cierre la tapa y selle las placas con cinta adhesiva transpirable. Cubra las partes de la raíz con cajas de papel negro para oscurecer las raíces y los hongos transmitidos por el suelo.
Incubar las placas verticalmente en la cámara de crecimiento. Realice los análisis en los puntos de tiempo preferidos después de la inoculación. Primero, esterilice vasos de plástico transparentes de 500 mililitros en un baño de etanol de 70 a 75% durante 20 minutos.
Seque las tazas en la campana de flujo de lámina. Vierta el medio en autoclave en los vasos de plástico. Prepare una capa de plástico con cinco orificios prefabricados, uno grande en el centro y cuatro más pequeños en cada esquina.
Coloque la capa de plástico en el medio antes de que se solidifique. Corta el agar con un bisturí a través del orificio central prefabricado a una profundidad de aproximadamente 1,5 centímetros. Retire el agar cortado para crear un canal de infección para agregar las esporas de hongos más tarde.
Rasca ligeramente el agar mediano con una punta de pipeta en los cuatro orificios más pequeños para interrumpir la piel solidificada. Coloque las semillas con una punta de pipeta en los orificios más pequeños. Cierre el vaso de plástico con un segundo vaso de plástico invertido y selle con cinta adhesiva transpirable.
Mantenga las plantas a cuatro grados centígrados durante tres días en la oscuridad para la estratificación. Luego incube los sistemas de copas en la cámara de crecimiento. Para inocular las plántulas con verticillium, agregue un mililitro de solución de conidios en el canal de infección.
Para los controles, agregue un mililitro de medio MS libre de gérmenes como una solución simulada. Realice los análisis en los puntos de tiempo preferidos después de la inoculación. Primero, mezcle bien el suelo y la arena en una proporción volumétrica de tres a uno, lo que facilita el lavado del sustrato de las raíces más tarde.
Vierta la mezcla en una bolsa de autoclave y cocine al vapor a 80 grados centígrados durante 20 minutos en un autoclave. Llene las macetas con la mezcla de tierra y arena y transfiéralas a bandejas. Agregue agua en las bandejas aproximadamente un tercio de la altura de una maceta para un remojo uniforme de la mezcla de tierra y arena.
Rocíe con agua la mezcla para asegurar condiciones de inicio húmedas. Siembre de tres a cuatro semillas en cada maceta a suficiente distancia entre sí. Manténgalos para la estratificación a cuatro grados centígrados durante tres días en la oscuridad.
Permita que las plántulas crezcan en condiciones de día largo con riego regular, luego elija plantas de tamaño y edad similares para realizar la inoculación por inmersión de la raíz. Saca el suelo de las macetas y excava las raíces. Lave suavemente las raíces en un recipiente de agua y mantenga las rosetas fuera del agua.
Incubar las raíces durante 60 minutos en una placa de Petri que contenga la solución de esporas de verticillium o solución simulada. Prepare macetas nuevas con tierra húmeda esterilizada por vapor sin arena. Use una punta de pipeta para hacer un agujero en el centro del suelo en cada maceta.
Coloque las raíces directamente en el agujero y vuelva a llenar los agujeros suavemente con tierra para evitar un estrés adicional para las plantas. Cultive las plantas en condiciones de día largo con riego regular. Realice los análisis en los puntos de tiempo preferidos después de la inoculación.
En el sistema basado en placas de Petri, se visualizó una infección exitosa de verticillium en las raíces de arabidopsis. Dos días después de la inoculación, el gen marcador MYB51 fue fuertemente inducido en las raíces infectadas en comparación con el control, lo que fue confirmado por el análisis QRTPCR. En el sistema basado en copas, se encontró una gran cantidad de ADN fúngico en las hojas de las plantas infectadas, como muestra el gráfico en comparación con el control simulado después de 12 días de inoculación.
El análisis QRTPCR mostró una abundancia de transcripción enriquecida del gen marcador MYB51 en las raíces de arabidopsis. Usando este sistema, verticillium fue inoculado a otras especies de plantas modelo. En la colza, el ADN fúngico fue detectable en segmentos de tallo cortados en la base de las plántulas 12 días después de la inoculación en las raíces.
También se detectó ADN fúngico en tallos de tomate que indican la propagación del patógeno dentro de la planta. 21 días después de la inoculación utilizando el sistema basado en el suelo, las rosetas de las plantas de arabidopsis tratadas simuladas se veían sanas y verdes, mientras que las plantas infectadas mostraban hojas amarillentas o necróticas y tenían un área de hojas verdes menor en relación con el simulacro que indica una infección exitosa. Preste atención al cortar el canal de infección en el sistema de placas de Petri para evitar que el agar se deslice.
Aplicando el sistema basado en el suelo, no comprima el suelo alrededor de las raíces mientras replanta para evitar un mayor estrés para las plantas. Después de la inoculación radicular, por ejemplo, se pueden realizar pruebas patogénicas, análisis de expresión génica, genómica funcional o pruebas agroquímicas que proporcionan nuevos conocimientos sobre las interacciones de los microbios radiculares y herramientas para mejorar la agricultura.
