La maggior parte delle piante in natura sono probabilmente interconnesse da funghi simbiotici che abitano radici chiamati funghi micorrizici. Questo metodo esamina esplicitamente come le reti micorriziche comuni influenzino le interazioni delle piante e le conseguenti conseguenze ecologiche. Con questo metodo, possiamo esaminare esplicitamente il ruolo delle reti micorriziche comuni consentendo al contempo a tutte le piante di essere colonizzate dai funghi, invece di escludere i funghi, il che si traduce in piante scarsamente coltivate.
Per iniziare a modificare i contenitori di piantine tubolari commerciali con plastica flessibile, utilizzare una pressa per trapano e tenere il contenitore contro una recinzione sulla pressa di perforazione e fermarsi con un tassello corto che si adatta all'interno del contenitore per aiutarlo a tenerlo in posizione durante la perforazione. Quindi, pratica due fori, uno sopra l'altro, ai lati del contenitore, in modo che i fori siano distanti circa un centimetro. Tagliare il pezzo di plastica sottile rimanente tra i fori per fare un'apertura allungata, larga circa due centimetri e lunga cinque centimetri.
Ripetere il taglio di queste aperture allungate sul lato opposto del contenitore. Per coprire le fessure con rete di nylon, tagliare la rete dei pori di 40 micrometri in tanti pezzi da 9,5 centimetri per 8,5 centimetri quanti sono i contenitori. Quindi, utilizzando colla a caldo industriale ad alta resistenza, fissare la rete di nylon esternamente sui contenitori per coprire entrambe le aperture, con una leggera sovrapposizione nel tessuto.
Applicare la colla a caldo intorno alle aperture sul contenitore e lungo i lunghi bordi sulla rete di nylon e arrotolare il contenitore sulla rete di nylon e sulla membrana idrofobica, se usato, per evitare di bruciare le dita. Aggiungere uno strato di colla lungo il bordo del tessuto in cui i bordi della rete si sovrappongono e premere il bordo su un cartone per sigillare saldamente. Una volta raffreddata la colla, utilizzare nastro flessibile per attaccare le estremità superiore e inferiore del tessuto al contenitore, per evitare bordi sciolti e strappi.
Usando lo stesso nastro, coprire i piccoli fori sui lati dell'estremità conica di ogni contenitore per evitare la crescita della radice dal contenitore nel resto della pentola. Posizionare un marmo di vetro sul fondo di ogni contenitore per evitare la perdita di suolo durante il drenaggio, quindi assemblare vasi come descritto nel manoscritto. Utilizzare contenitori solidi e non modificati per un trattamento di controllo che non comporti alcun potenziale di formare una CMN tra le piante.
Aggiungere am fungo inoculo al terreno, mescolando uniformemente pezzi di radice tritati lunghi 1,2 centimetri accuratamente con il terreno. Selezionare un terreno desiderato mescolato con una sabbia di silice sterile o perline di vetro per ridurre la concentrazione di nutrienti minerali disponibili per le piante. Posizionare i contenitori riempiti in schiuma forata costruita in precedenza nelle pentole.
Per rendere la miscela di sabbia silicea povera di nutrienti di drenaggio adeguato, mescolare sabbia di medie dimensioni delle particelle con sabbia di piccole dimensioni delle particelle in una betoniera. Riempire lo spazio interstiziale con questa miscela utilizzando un imbuto per aiutare a riempire piccoli spazi. Successivamente, il pretrattamento dei trapianti, o le cosiddette piante infermiere, delle specie desiderate in ogni contenitore per sostenere i funghi AM, che si diffonderà tra i contenitori e stabilirà reti micorriziche comuni.
Coltivare le piante per due o tre mesi a circa 24 gradi Celsius in una serra per consentire lo stabilimento cmn. Cucire piante sperimentali seminando in contenitori. Attendere che tutti i contenitori abbiano piantine germinate prima di rimuovere le piante infermiere pretrattamento, tagliando i loro germogli.
Per stabilire trattamenti CMN, lasciare alcuni contenitori non spostati per tutta la durata dell'esperimento. Per modificare fisicamente le ife che si estendono tra i contenitori modificati, ruotare alcuni dei contenitori settimanalmente, assicurandosi di farlo attraverso un'unica rotazione completa, per evitare di alterare involontariamente le interazioni fuori terra. Subito dopo la rotazione, innaffiare pesantemente tutti i vasi per ristabilire il contatto tra il substrato interstiziale e i lati dei contenitori.
Immergere tutti i vasi con acqua dopo aver recideto le reti micorriziche comuni è fondamentale per ristabilire il contatto tra il contenitore e il substrato interstiziale, prevenendo così l'aerazione involontaria dei contenitori. Fertilizzare le piante vicine con lo 0,5% di azoto 15 nitrato di potassio arricchito e cloruro di ammonio. Fertilizzare l'individuo bersaglio con un fertilizzante azoto 14 di uguale concentrazione.
Ri-randomizzare le posizioni dei vasi nel corso dell'esperimento, almeno mensilmente. Misura la crescita settimanalmente misurando la lunghezza delle foglie più lunga, per monitorare quando la crescita inizia a rallentare, assicurandoti di raccogliere prima che le piante diventino legate alla radice. Per raccogliere, ritagliare tutto il tessuto fuori terra e posizionare singole piante in buste etichettate con il loro trattamento, pentola e posizione.
Quindi asciugare i tessuti fuori terra a 60 gradi Celsius in un forno di essiccazione ad aria forzata, a peso costante, e quindi misurare il peso secco di ogni tessuto vegetale. Lasciare asciugare il terreno da due a tre giorni prima di rimuovere i contenitori e raccogliere le radici. Dopo la raccolta, spazzolare delicatamente il più possibile il terreno dai sistemi di radici.
Lavare le radici su un setaccio con dimensioni dei pori da 250 micron, per evitare la perdita della radice. Dopo aver permesso alle radici di asciugarsi all'aria, pesare l'intero apparato radicale. Ritagliare il sistema radice in modo casuale e posizionare i frammenti in 50%etanolo.
Pesare di nuovo il sistema radicale rimanente e conservarlo in una busta di carta etichettata per asciugare a 60 gradi Celsius per la valutazione del peso secco. Durante la coltivazione di Andropogon gerardii Vitman in un esperimento di pianta bersaglio, recidendo o prevenendo le CMN è diminuito il peso secco fuori terra dell'obiettivo, suggerendo che le CMN intatte promuovevano la crescita delle piante. Le piante con CMN recise e senza CMN hanno risposto in modo simile ai loro trattamenti.
La competizione, in cui la crescita di un individuo sopprime la crescita di un altro individuo vicino, è stata rilevata nel trattamento CMN intatto, ma non nei trattamenti CMN recisi o non. Confronti approfonditi delle diverse concentrazioni di tessuto fogliare di nutrienti minerali, rispetto alle concentrazioni di manganese di dimensioni vegetali, sono stati positivamente associati ai pesi secchi fuori terra delle piante bersaglio, in tutti i trattamenti. Il tessuto vegetale bersaglio è stato valutato per l'azoto 15 nei tessuti fogliari rispetto alle dimensioni delle piante, dopo aver aggiunto l'etichetta azoto 15 solo ai contenitori dei vicini.
Le piante bersaglio con CMN intatte avevano concentrazioni di azoto 15 più elevate, rispetto ad entrambi gli altri trattamenti. Le CMN intatte avevano una pendenza di azoto fortemente positiva e significativamente diversa, da quella del trattamento con CMN recise, suggerendo che le grandi piante hanno ottenuto più azoto dalle CMN che raggiungono i contenitori vicini, rispetto ai piccoli individui bersaglio. In un esperimento sul campo utilizzando nuclei ruotati in tubo di PVC, il micelio extraradicale oltre i tubi ha avuto poco effetto sulla crescita del mirtillo durante l'esperimento di 13 mesi.
Tuttavia, reciderlo per rotazione di tubi riduceva le concentrazioni fogliare di azoto, fosforo e rame, sostanzialmente mostrate dalle piante clorotiche. Ruotare i contenitori nella stessa direzione in cui il tessuto è incollato su ogni contenitore per evitare lo strappo del tessuto e ruotare di 360 gradi per ridurre le modifiche fuori terra alle piante. Questa procedura può essere utilizzata sul campo con tubi in PVC modificati riempiti con terreno sterile per esaminare il ruolo del micelio extraradicale nella colonizzazione delle radici e la sua influenza sull'assorbimento dei nutrienti.
Questa tecnica consente il confronto di piante con reti micorriziche comuni, a piante micorriziche che non sono interconnesse da reti, invece che a piccole piante senza micorrize, come viene fatto più spesso.
