Este ensayo vincula la modulación de la estructura bacteriana y la función a la actividad antibacteriana basada en células inmunitarias. Como tal, se puede evaluar una inmunoterapéutica clave de un tratamiento potencial para determinar la probabilidad de un aclaramiento bacteriano mejorado. El ensayo de matanza opsonofofática tradicionalmente sirve como el estándar de oro para evaluar las funciones efectivas de los anticuerpos levantados contra la bacteria como obsonantes.
Este protocolo ofrece simplicidad y versatilidad sobre los ensayos estandarizados de alto rendimiento existentes. En este protocolo, investigamos los efectos de un tratamiento farmacológico sobre la neumonía por estreptococos y cómo estos efectos se traducen en una mejor fagocitosis de la bacteria. Aquí, aplicamos el OPKA a las células de la neumonía por estreptococos.
Sin embargo, este protocolo se puede adoptar para evaluar la matanza fagocítica de otros patógenos por las células inmunitarias. Dedique tiempo a optimizar las existencias bacterianas y asegúrese de que las UFC finales a contar estén dentro del rango óptimo. Recomendamos encarecidamente el uso de citometría de flujo para garantizar que las células HL60 sean viables y activas y que intenten diferentes condiciones de cultivo para garantizar células funcionalmente activas.
La demostración visual dará una mejor comprensión de cómo se debe planchar la muestra y cómo lograr muestras contables. Para empezar, preparar medios de cultivo celular HL60 compuestos por 500 mililitros RPMI complementados con L-glutamina y 15 mililitros calor inactivado suero bovino fetal. Para la propagación y mantenimiento de células HL60, cultivo de cinco millones de células en 10 mililitros de medios de cultivo celular HL60 en matraces ventilados de 75 centímetros cuadrados a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono.
Para generar reservas de trabajo de células HL60, añadir aproximadamente un millón de células por mililitro en medios de cultivo HL60 complementados con 10%dimetil sulfóxido en tubos criogénicos de un mililitro. Para diferenciar las células HL60, el cultivo 1,5 veces 10 a las siete células en 15 mililitros de medios de cultivo celular HL60 complementado con 0,6% DMF en un filtro estéril con un filtro estéril de 75 centímetros cuadrados a 37 grados centígrados y un 5% de dióxido de carbono durante tres días antes de OPKA. Para preparar las muestras de stock bacteriano, haga crecer la cepa bacteriana WU2 en un caldo apropiado durante aproximadamente dos a cuatro horas a 37 grados centígrados.
A continuación, pelecifa las bacterias por centrifugación a seis mil veces G durante dos minutos y resuspendir las células en 10 a 30 mililitros de 15% de glicerol en el caldo apropiado. Aliquot el cultivo de bacterias en tubos estériles de centrífuga de 1,5 mililitros y almacenar a 80 grados centígrados. A continuación, descongelar un vial de stock bacteriano en un baño de agua de 37 grados centígrados.
Pelecilar las células bacterianas y resuspender en 500 microlitros de OBB en condiciones estériles. Diluciones de placas del stock bacteriano no tratado en placas de agar de sangre y cultivar las placas durante la noche a 30 grados centígrados. Después del paso de incubación, cuente las colonias para cada dilución de la población bacteriana no tratada co-cultivada con células HL60.
Registro de qué dilución de bacterias produce el número óptimo de colonias contabibles para futuros OPKAs con este stock bacteriano. Descongelar un tubo de stock bacteriano. Bacterias del pellet a seis mil veces G durante dos minutos y resuspend el pellet celular en OBB en la dilución óptima obtenida en el paso anterior.
Pipetear 10 microlitros de la dilución bacteriana resuspendida por pozo en una placa redonda de cultivo celular de 96 pozos. A continuación, agregue 20 microlitros de un anticuerpo adecuado o un tratamiento farmacológico a cada pozo experimental por duplicado. Para pozos de control, utilice 1XPBS u OBB dependiendo del tampón utilizado para los pozos de tratamiento.
Agitar la placa de muestra a aproximadamente 90 rpm a temperatura ambiente durante una hora. Para cosechar las células diferenciadas HL60 que se tratan con DMF tres días antes, pele las células a 500 veces G durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y lave el pellet con al menos 10 mililitros de 1XPBS.
Pele el pelado de las células lavadas a 500 veces G durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend las células en OBB. Agregue suero estéril de conejo bebé sin diluir a un volumen final de uno a cinco.
Después de un cultivo bacteriano de una hora, divida cada muestra en pozos duplicados para dos grupos. A continuación, añadir 50 microlitros de la mezcla de complemento HL60 a cada conjunto experimental de pozos y 50 microlitros de OBB a los pozos de bacterias solamente. Agitar la placa de 96 pozos a 37 grados centígrados durante una hora.
Para las muestras de placas, diluir cada pozo con OBB a un volumen final de uno a cinco para que cada muestra tenga un volumen de al menos 50 microlitros. A continuación, pipetear 50 microlitros de cada muestra directamente en un área designada de una placa de cultivo bacteriano, asegurando un espacio adecuado entre las muestras. Cubra y deje que las muestras se sequen durante aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente.
Invertir las placas y el cultivo durante la noche a 30 grados centígrados. Alternativamente, placas de cultivo en frascos anaeróbicos para probar si las condiciones anóxicas afectan el crecimiento bacteriano o para controlar la morfología. Después del cultivo nocturno, cuente las colonias en cada área de muestra designada y proceda al análisis de datos comparando el número de celdas vivas en cada conjunto con los controles correspondientes.
Los aspectos más difíciles de establecer esta técnica por primera vez probablemente serán la optimización de las UFC iniciales de la población bacteriana, así como asegurar que las células HL60 se diferencien efectivamente. Antes de iniciar el OPKA, la diferenciación de HL60 se validó utilizando citometría de flujo con yoduro propidio como marcador de viabilidad. Después de ser tratado con DMF durante tres días, la expresión de CD35 se incrementó y la expresión de CD71 disminuyó.
Los porcentajes medios de UFC bacterianas en los grupos tratados con HL60 en comparación con los grupos tratados no HL60 correspondientes se utilizaron para comparar la supervivencia celular bacteriana de diferentes tratamientos. Los resultados mostraron que con un tratamiento eficaz, el número de colonias era diferente entre el co-cultivo hl0 y ninguna célula HL60, indicativo de la fagocitosis más eficiente. Los resultados mostraron que cuando la dilución bacteriana no se optimizó o el crecimiento de la colonia no se observó cuidadosamente después del chapado, el crecimiento excesivo de las colonias podría evitar el recuento preciso de colonias.
Lo más importante a recordar al intentar este procedimiento es controlar cuidadosamente la incubación bacteriana para evitar el crecimiento excesivo de las UFC. Los ensayos in vivo se pueden utilizar para obtener un aclaramiento bacteriano efectivo dentro de un huésped. Estos ensayos se pueden utilizar para confirmar que la eficacia inmune observada con el OPKA es traducible a modelos humanos o animales.
El ensayo de matanza opsonophagotic se ha utilizado con gran efecto en estudios de investigación significativos anteriores para vincular terapias antibacterianas con las respuestas inmunitarias fagosticas. Trabajar con patógenos bacterianos puede ser peligroso. Por favor, use equipo personal de protección en todo momento durante este ensayo.
