이 분석법은 세균 구조의 변조와 면역 세포 기반항균 활성에 기능을 연결합니다. 따라서, 잠재적인 처리의 중요한 면역 치료는 향상한 세균성 정리의 가능성을 결정하는 에서 평가될 수 있습니다. 편협성 살인 분석은 전통적으로 강균에 대해 제기 된 항체의 효과적인 기능을 평가하기위한 금 본위제 역할을합니다.
이 프로토콜은 기존의 높은 처리량 표준화 된 분석보다 단순성과 다기능성을 제공합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 연쇄상 구균 폐염에 대한 약물 치료의 효과와 이러한 효과가 박테리아의 향상된 phagocytosis로 변환하는 방법을 조사합니다. 여기서, 우리는 연쇄상 구균 폐염 세포에 OPKA를 적용합니다.
그러나 이 프로토콜은 면역 세포에 의한 그밖 병원체의 phagocytic 살인을 평가하기 위하여 채택될 수 있습니다. 세균 주식을 최적화하고 최종 CFO가 최적의 범위 내에 속하는지 확인하는 데 시간을 바칩니다. HL60 세포가 실행 가능하고 활성상태이며 기능적으로 활성 세포를 보장하기 위해 다른 배양 조건을 시도하는 것이 좋습니다.
시각적 데모는 샘플을 도금하는 방법과 계산 가능한 샘플을 달성하는 방법을 더 잘 이해할 수 있습니다. 시작하려면 L-글루타민으로 보충된 500밀리리터 RPMI와 15밀리리터열 불활성 태아 소 혈청으로 구성된 HL60 세포 배양 미디어를 준비하십시오. HL60 세포의 전파 및 유지 보수를 위해 75 평방 센티미터의 HL60 세포 배양 매체의 10 밀리리터에서 5 백만 개의 세포를 배양하여 섭씨 37도및 이산화탄소 5 %의 플라스크를 배출합니다.
HL60 세포의 작동 주식을 생성하려면 HL60 배양 배지에 밀리리터 당 약 1백만 개의 세포를 1밀리리터 극저온 튜브에 10% 디메틸 설프리산화물로 보충합니다. HL60 세포를 분화하기 위해, 배양은 HL60 세포 배양 배지의 15 밀리리터에서 7세포에 1.5배 10배, 멸균 필터에 0.6%DMF로 보충된 멸균 필터에 75평방센티미터플라스크는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 OPKA 이전 3일 동안 1.5배 10배 로 보충하였다. 세균성 주식 샘플을 준비하려면, 37섭씨에서 약 2 ~4 시간 동안 적절한 국물에 WU2 세균 균주를 성장.
다음으로, 2분 동안 6천 회 G에서 원심분리에 의해 박테리아를 펠렛하고 적절한 국물에 15%의 글리세롤의 10~30밀리리터에서 세포를 재보페킹한다. Aliquot 균 배양 멸 균 1.5 밀리 리터 원심 분리 튜브와 80 섭씨에 저장. 다음으로, 37도 섭씨 수조에서 세균육 육유 1병기를 해동합니다.
세균 성 세포를 펠렛 하 고 멸 균 조건 하에서 OBB의 500 마이크로 리터에서 다시 중단. 혈액 한천 접시에 치료되지 않은 세균 주식의 플레이트 희석과 30섭씨에서 하룻밤 동안 접시를 배양. 인큐베이션 단계 후, HL60 세포와 함께 배양된 처리되지 않은 세균 육수의 각 희석에 대한 콜로니를 계산한다.
박테리아의 희석이 박테리아 재고와 미래의 OPKA에 대 한 카운트 가능한 식민지의 최적 수를 산출 기록. 박테리아 육수의 튜브 를 해동. 펠릿 박테리아는 2분 동안 6천 회 G에서 박테리아를 회수하고 이전 단계에서 얻은 최적의 희석으로 OBB의 세포 펠릿을 재중단한다.
파이펫 10 마이크로리터의 재중단 된 세균 희석제는 라운드 하단 96 웰 세포 배양 판에서 잘 한다. 그런 다음, 적절한 항체 또는 약물 치료의 20 마이크로리터를 복제하여 각 실험에 잘 첨가한다. 제어 우물의 경우, 치료 우물에 사용되는 버퍼에 따라 1XPBS 또는 OBB를 사용합니다.
실온에서 약 90rpm에서 1시간 동안 샘플 플레이트를 흔들어 주세요. 3일 전에 DMF로 처리되는 HL60 분화 세포를 수확하기 위해 3분 동안 500회 G로 세포를 펠릿한다. 상체를 버리고 1XPBS의 적어도 10 밀리리터로 펠릿을 씻으십시오.
세척된 셀을 500회 G로 3분간 펠렛합니다. 상체를 버리고 OBB의 셀을 다시 중단합니다. 멸균 희석되지 않은 아기 토끼 세럼을 1~5권에 넣습니다.
1 시간 세균 배양 후, 두 그룹에 대한 중복 우물에 각 샘플을 분할. 다음으로, HL60의 마이크로리터 50개를 각 실험용 우물 세트에 넣고, 50마이크로리터의 OBB를 박테리아 의 우물에만 넣습니다. 96 웰 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 흔들어 보겠습니다.
플레이트 샘플을 위해, 각 샘플이 최소 50 마이크로리터의 부피를 가지고 있도록 1 ~ 5 최종 부피에서 OBB와 각 잘 희석. 다음으로, 각 샘플의 파이펫 50 마이크로리터가 세균 배양 판의 지정된 영역에 직접 위치하여 시료 간의 적절한 간격을 보장합니다. 실온에서 약 15분 동안 샘플을 덮고 건조시 로 건조시키십시오.
접시와 문화를 섭씨 30도에서 하룻밤 동안 반전하십시오. 대안적으로, 혐기성 항아리에 있는 배양 판은 무산소 조건이 세균성 성장에 영향을 미치는지 또는 형태학을 통제하기 위하여 시험하기 위하여. 야간 배양 후 지정된 각 샘플 영역에서 콜로니를 계산하고 각 세트의 라이브 셀 수를 해당 컨트롤과 비교하여 데이터를 분석합니다.
처음으로 이 기술을 확립하는 가장 어려운 양상은 HL60 세포가 효과적으로 분화되도록 하는 것 뿐만 아니라 세균 주식의 시작 CFO를 최적화하는 것입니다. OPKA를 시작하기 전에 HL60 분화는 생존 가능성 마커로서 프로피듐 요오드를 이용한 유동 세포측정을 사용하여 검증되었습니다. 3일 동안 DMF로 처리된 후 CD35의 발현이 증가하고 CD71의 발현이 감소하였다.
HL60 치료군에서 세균성 CFUs의 평균 백분율은 상이한 치료의 세균세포 생존을 비교하기 위해 사용하였다. 결과는 효과적인 처리로, 식민지의 수는 HL60 공동 배양및 더 HL60 세포 사이에서 달랐다는 것을 보여주었습니다, 더 능률적인 phagocytosis의 표시. 결과는 세균 희석이 최적화되지 않았거나 식민지 성장이 도금 후에 주의 깊게 관찰되지 않았을 때, 식민지의 과성장은 식민지의 정확한 계산을 방지할 수 있었다는 것을 보여주었습니다.
이 절차를 시도할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 CfU의 과성장을 피하기 위해 세균 배양을 주의 깊게 모니터링하는 것입니다. 생체 내 의 소법은 숙주 내에서 효과적인 세균 성 클리어런스를 어지런하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 소는 OPKA와 함께 관찰된 면역 효능이 인간 또는 동물 모델과 전이가능한지 확인하는 데 사용될 수 있다.
opsonophagocytic 살인 분석 은 파고스틱 면역 반응에 항균 요법을 연결하는 이전 중요한 연구 연구에서 큰 효과를 위해 사용되었습니다. 세균성 병원균으로 일하는 것은 위험할 수 있습니다. 이 분석 중에 항상 보호 개인 장비를 착용하십시오.
